疟原虫抗药性的遗传学研究进展

　　摘　要　疟原虫产生抗药性是疟疾防治中遇到的主要难题之一。抗叶酸类抗疟药的抗药性机制已基本搞清，与其作用靶酶二氢叶酸还原酶或二氢蝶酸合成酶基因点突变相关。喹啉类药物抗性影响因子尚不完全清楚。恶性疟原虫5号染色体上的多药耐药基因1及7号染色体上的cg2基因可能是抗性相关基因，但二者都不能完全解释抗性，尚待深入研究。

　　疟疾的流行至今仍然十分广泛，遍及全球90多个国家和地区，20亿人面临感染疟疾的危险。据统计，全球每年有3亿～5亿疟疾病例，导致150万～270万人死亡，其中100万是居住在非洲的5岁以下儿童［1］。人类在长期实践过程中筛选了大量防治疟疾的药物，但是，自从50年代末在东南亚和南美洲分别发现恶性疟原虫对氯喹产生抗药性以后，抗氯喹恶性疟迅速扩散蔓延，抗药性程度不断增加，并且从单药抗药性向多药抗药性发展。我国的海南、云南和广西等省、自治区也有抗药性疟疾的流行。目前，疟原虫对几乎每一种抗疟药都产生了抗性，疟疾防治形势非常严峻，迫切要求我们尽快搞清抗药性产生的机制，以便采取措施防止或逆转抗药性的发生并指导新药研究。近年来，分子生物学技术的发展及学科渗透大大推动了疟原虫抗药性机制的遗传学研究，本文就抗叶酸制剂及喹啉类药物抗性的分子机制作一综述。

　　1　抗叶酸制剂抗性的分子机制

　　1.1　二氢叶酸还原酶（DHFR）基因

　　乙胺嘧啶和环氯胍都是二氢叶酸还原酶抑制剂。研究表明，恶性疟原虫对两药产生抗药性都与DHFR基因点突变相关，但二者存在差异［2,3］。迄今为止，共报道了6个DHFR基因编码区变异：108位Ser→Asn或Thr,51位Asn→Ile,59位Cys→Arg,16位Ala→Val,164位Ile→Leu。单一点突变所致DHFR108位Ser变异成Asn即可产生乙胺嘧啶抗性，但对环氯胍的反应性仅稍有降低。对乙胺嘧啶产生高度抗性则需其他位点突变共存，包括51位Asn→Ile和（或）59位Cys→Arg。而与环氯胍抗性相关的变异是DHFR108位Ser→Thr伴随16位Ala→Val，同样，该抗性株对乙胺嘧啶的敏感性变化不大。

　　另外，在对乙胺嘧啶和环氯胍交叉耐药的恶性疟原虫中发现存在多个位点变异：DHFR164位Ile→Leu,108位Ser→Asn,59位Cys→Arg和（或）51位Asn→Ile。由于仅包含Asn-108和Arg-59变异的原虫分离物不具有环氯胍抗性，因此，认为Leu-164变异在疟原虫对两药产生交叉抗性的机制中起重要作用［3］。

　　1.2　二氢蝶酸合成酶（DHPS）基因

　　磺胺类药是二氢蝶酸合成酶抑制剂。研究发现，正是由于磺胺类药作用的靶酶DHPS基因点突变，使得酶活性中心结构域形状改变，因而降低了对药物的敏感性。体外低叶酸条件下实验表明［4］，与磺胺多辛易感性降低相关的DHPS氨基酸变异主要包括581位Ala→Gly,436位Ser→Phe伴随613位Ala→Thr/Ser,以及436位Ser→Ala,437位Ala→Gly。

　　磺胺多辛通常与乙胺嘧啶合用于治疗恶性疟疾。对两药联用的体外研究揭示，疟原虫对乙胺嘧啶的易感性决定着两药协同作用的效果［5］。体内研究也发现［6］，前面所述的DHFR变异类型均存在并与抗性程度相关，而DHPS基因突变与抗性的发生没有明显相关性，仅在抗性程度较高的玻利维亚地区可见Gly-581高度流行,Gly-437和Glu-540的发生与用乙胺嘧啶-磺胺多辛治疗失败率相当，这可能由于体外研究中叶酸和PABA水平不同于体内。另一种解释是Ala-436的变异可能仅在低度抗性时出现，且不与高度抗性时的变异Gly-437,Glu-540和Gly-581共存。因此推测，DHPS变异在临床乙胺嘧啶-磺胺多辛抗性的产生中不起主导作用。

　　我们能够肯定，体内乙胺嘧啶-磺胺多辛抗性与DHFR基因突变相关，然而在抗性疟流行区治疗失败率并不像突变发生率那样高，提示体外研究发现的三种变异Asn-108，Ile-51和Arg-59不能完全解释体内高度抗性。在玻利维亚的高度抗性病例中曾发现Leu-164及另外两个新的变异Arg-50和插入30-31位间的玻利维亚重复区高度流行，提示这些变异可能是在抗性发展的较高时期产生的，关系到治疗的成败。据此Plowe等［6］提出假设，体内乙胺嘧啶-磺胺多辛抗性程度分级RⅠ,RⅡ,RⅢ正是基于DHFR和DHPS基因突变的不断积累。由于现实中恶性疟原虫感染的复杂性及宿主免疫与叶酸水平的影响，事实上所检测到的抗性突变往往是交叉重叠的。

　　总之，关于抗叶酸制剂的抗药性分子机制已基本搞清。因此，我们可以根据特有的突变类型，运用分子生物学的方法，进行大规模的流行病学研究，这对于鉴定某一疟疾流行区的药物敏感性，从而指导临床用药具有重要意义；同时也可指导新药设计及临床药物联用，以最大限度地减少药物抗性的发生。

　　2　喹啉类药物抗性的分子机制

　　氯喹曾经是使用最广泛的抗疟药，由于抗性的发展及传播，在大部分地区已不再具有以往的效力。影响抗性机理最终阐明的重要因素是喹啉类药物作用机制还不十分清楚。不同地区的研究者报道关于氯喹抗性的一个共同特征是：抗氯喹虫株较敏感性虫株药物聚集水平降低了。因此，氯喹的转运和聚集不仅对其发挥抗疟活性是必需的，而且与抗性表型密切相关，提示喹啉类药物抗性产生可能与其作用方式没有直接关系，这与抗叶酸制剂不同。

　　2.1　恶性疟原虫多药耐药基因（pfmdr1和pfmdr2）

　　研究发现，维拉帕米（一种钙通道阻滞剂）可逆转氯喹抗药性，促使人们考虑氯喹抗性可能与哺乳动物肿瘤细胞多药抗药性（MDR）表型相似［7］。研究表明，肿瘤细胞产生MDR是由于一种ATP依赖性的、与药物外排相关的蛋白过量表达所致，称为P-糖蛋白，它定位于细胞表面，与许多不同类型的化合物有亲合力［8］。在此基础上，Krogstad等［9］发现抗氯喹株原虫较敏感株排出氯喹的速率快40～50倍，且这种排出是能量依赖性的，并可被能量缺乏及ATP阻断剂抑制。但是也有研究显示,抗氯喹株与敏感株药物外排率相等［10］；二者药物聚集量的差别是由于最初的药物摄入速率不同所致［11］。

　　哺乳动物MDR表型通常伴有mdr基因的扩增，导致其产物P-糖蛋白表达增加［8］。对恶性疟原虫基因的研究表明也存在mdr基因同系物，以pfmdr1和pfmdr2为主［12，13］。目前尚无证据表明pfmdr2及其表达产物与氯喹抗性有关，而有相当多的研究认为pfmdr1与抗药性机制相关。

　　Pfmdr1编码一个相对分子质量约162的蛋白，称为P-糖蛋白同系物1（Pgh1）。早期研究表明，在一些抗氯喹株中存在pfmdr1扩增［12，13］。免疫荧光及免疫电镜技术观察pfmdr1蛋白产物，发现Pgh1在红内期表达，主要定位于食物泡膜上，这与它可能充当氯喹转运蛋白的角色一致，但是定量分析不能确认Pgh1过表达与抗药性相关［14］。

　　Foote 等［15］对pfmdr1基因3′多态性及等位基因变异分析表明，pfmdr1突变与氯喹抗性表型相关，并提出存在两种类型抗性相关等位基因，一种可致单一氨基酸变异86位Asn→Tyr，为K1型；另一种则导致三种氨基酸变异，1034位Ser→Cys、1042位Asn→Asp和1246位Asp→Try,为7G8型。这可能分别代表着最早在东南亚和南美洲出现的氯喹抗性类型。以此为基础，运用单盲法研究，曾正确地预测了36份样品中的34份的药物易感性。Adagu等［16］的研究也表明86位Tyr突变与氯喹抗性相关。但是，同时有些研究不能得到相同的结果。这提示可能pfmdr1不是唯一的控制抗性的基因。

　　氯喹抗性与pfmdr1的关系尚不明确，从选自氯喹抗性亲代的甲氟喹抗性株中却发现有pfmdr1的扩增，并且虫株对甲氟喹抗性增加的同时对氯喹的易感性增加了［12］。Barnes等［17］的研究表明，随着原虫对氯喹抗性的增加，pfmdr1基因拷贝数减少，甲氟喹易感性增加，这无疑加强了pfmdr1扩增与甲氟喹抗性的关联。因此推测pfmdr1扩增可能与氯喹高度抗性是不相容的，Pgh1的功能可能是促进对氯喹的易感性。

　　将pfmdr1基因转染于异源表达系统中国仓鼠卵巢细胞（CHO），使其表达恶性疟原虫Pgh1，发现Pgh1表达伴随有能量依赖性的药物摄入增加［18］，而且Pgh1就定位于转染的CHO细胞溶酶体上，经测定，发现转染细胞溶酶体内pH值有所下降，认为氯喹聚集增加可能是溶酶体酸化的结果，推测pfmdr1可能编码一种液泡氯化物通道。当CHO细胞被携带有7G8型1034和1042位突变的pfmdr1基因转染时，则发现氯喹易感性丧失，细胞聚集药物及酸化溶酶体的能力减弱，这就从某种意义上证实了关于Pgh1促进氯喹易感性的推测。但这仍不足以解释抗性。Ritchie等［19］发现源自氯喹抗性亲代的卤泛曲林抗株表现对卤泛曲林、甲氟喹和奎宁敏感性降低而对氯喹敏感性增强，却未检测到任何pfmdr1基因序列或拷贝数及Pgh1表达的变化。

　　很明显，关于pfmdr1与喹啉类药物抗性的关系仍有很大疑问，可能抗性的发生有一定的地理学基础，而寻找某个单一的基因来解释抗性本身过于简单化，氯喹抗性发生的缓慢及复杂性也不支持单基因决定抗性的假设。

　　2.2　cg1基因和cg2基因

　　早在90年代初，Wellems等［20］从一次遗传杂交试验中发现疟原虫抗氯喹表型以孟德尔方式遗传，亲代pfmdr1基因不与子代药物反应表型分离。对杂交子代进一步观察发现氯喹抗性表型与恶性疟原虫7号染色体上约400 kb的区域相关而不是5号染色体的pfmdr1基因。这一区域包含80～100个基因，对该区域进行大量的分析研究后［21］，确定36 kb的片段与氯喹抗性表型相关，并鉴定了2个候选基因：cg1和cg2。对采自东南亚和非洲大量的抗氯喹株检测结果表明，cg1尤其是cg2基因多态性与氯喹抗性显著相关，但不排除cg1与cg2协同参与了抗性。不过，对南美洲抗氯喹株的检测没有得到同样结论。运用免疫电镜技术观察到CG2蛋白定位于原虫周围液泡、食物泡及囊泡结构形成的外膜复合物上，暗示CG2可能是一种转运蛋白。然而检索序列数据库未发现CG2与任何已知离子通道或转运蛋白同源。

　　Sanchez等［22］认为在氯喹抗性过程中，有转运分子在起作用，一个Na+/H+交换蛋白（NHE）可能调控着氯喹的摄取。已证实恶性疟原虫以一种热敏感的可饱和的方式主动摄取氯喹，并可被高等真核生物NHE的特异性抑制剂氨氯吡咪竞争性抑制。运用与Su等同样的亲代子代克隆研究发现，氯喹抗性表型与恶性疟原虫NHE的生理生化特征有遗传学关联。因此，Sanchez等［23］推测恶性疟原虫cg2基因可能编码Na+/H+交换蛋白，他们认为两者可能有共同的结构和功能，比如氨氯吡咪结合位点、与NHE离子交换区同源等。但是，Wellems等［24］详细分析了CG2蛋白序列，不支持上述观点。首先，尽管CG2序列有一些疏水性氨基酸，却没有整合膜蛋白的典型特征，疏水性与跨膜区域分析表明，NHE与CG2有显著差别。其次，CG2与NHE离子交换区域不具有同源性，Sanchez等提出的CG2有氨氯吡咪结合位点也没有可靠的根据。此外，如果CG2是一种整合膜Na+/H+交换蛋白，应当定位于胞浆膜上，而不是原虫周围液泡及食物泡上。

　　Wellems等［24］认为CG2不是转运蛋白，而是通过直接影响氯喹摄入、血红蛋白消化、血红素聚合或血红素与氯喹复合物的毒性作用来调控原虫对氯喹的易感性，但需要进一步的生化实验及蛋白功能研究才能确定其确切机制。

　　总之，关于喹啉类药物抗性机制已提出了多种理论，虽然每种理论都不能完全解释抗性，但是这些研究对于搞清抗性机制有着重要的意义。随着现代药理学、生物化学及分子生物学的发展，我们有理由相信在不久的将来能够阐明这一问题。

　　［作者简介］　魏晓莉(1972-)，女，山西阳泉人，在读硕士生。

　　魏晓莉（军事医学科学院微生物学流行病学研究所，北京　100071)

　　时云林（军事医学科学院微生物学流行病学研究所，北京　100071）

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