杜氏利什曼原虫前鞭毛体的培养和染色方法的改进

AN IMPROVEMENT ON THE METHODS OF CULTURING AND

　　DYEING FOR THE PROMASTIGOTE OF

　　LEISHMANIA DONOVANI

Wang Kexin

　　(Dept.Parasitology,Inner Mongolia college of Traditional Mongolian Medicine,Tongliao 028041)

　　Song Baohua

　　(Dept.Parasitology,Inner Mongolia college of Traditional Mongolian Medicine,Tongliao 028041)

　　Yin Meizhen

　　(Dept.Parasitology,Inner Mongolia college of Traditional Mongolian Medicine,Tongliao 028041)

　　Wang Yan

　　(Dept.Parasitology,Inner Mongolia college of Traditional Mongolian Medicine,Tongliao 028041)

　　诊断黑热病最可靠的方法是检查病人体内有无病原体。但有时由于所得的材料含虫量较少，涂片检查往往为阴性，给诊断带来一定困难。为提高病原体检出率和诊断率，常采用体外培养法培养出前鞭毛体(promastigote)后再进行制片，染色。培养时一般多采用三N(Nory-MacNeal-Nicoll)培养基，但通过多年实践，我们发现三N培养基由于温度的作用和在试管内较长时间的液体浸泡，使培养基变得脆而软，制片时出现许多琼脂碎片；涂片前也因反复洗涤离心的作用均影响了制片效果。为提高黑热病诊断依据和制片的质量，我们经反复试验，对三N培养基和涂片染色法进行了某些改进，效果很好。现介绍如下。

　　1　材料和方法

　　1.1　三N培养基础

　　琼脂18g(原为14g);氧化钠6g;蒸馏水900mL

　　在培养之前加入培养基全量1/4量的消毒去纤维蛋白的兔血(即3mL溶解琼脂加入1mL兔血混匀)，操作步骤按人体寄生虫学(中山医学院，1979)介绍的原方法，但由试管法改用小平皿培养法。培养时将取自患者体内的材料(如骨髓液、淋巴结穿刺液)或阳性的鼠肝、脾组织的虫体悬液(用研钵研磨成匀浆而成)，用白金耳挑取，直接接种于小平皿培养基的表面，接种前将培养基内加入青霉素、链霉素各2万单位，防止污染，置22～25℃温箱内培养10～12天，以上操作均要求严格无菌。

　　1.2　涂片

　　以往所用的前鞭毛体涂片染色法，一般将含有前鞭毛体的培养基经3次洗涤离心后做涂片染色，我们发现经离心洗涤后的前鞭毛体虽然较纯净，但大部分前鞭毛体的鞭毛被折断脱落，前鞭毛体聚结在一起的菊花状排列被冲散，失去了自然状态。为弥补上述不足，我们将涂片染色也予以改进。

　　1.2.1　涂片时间：选择经三N培养基培养10天的前鞭毛体做涂片染色，此时的前鞭毛体生长正值旺盛阶段，其外型及内部结构完好清晰，为涂片染色的最好时机。

　　1.2.2　涂片方法：先在干净的玻片上加一小滴生理盐水，再用白金耳挑取小平皿培养基表面的虫落，然后在玻片的生理盐水上轻蘸一下，用手轻摇玻片，使水滴散开，晾干后，甲醇固定，姬氏染色。

　　1.3　染色

　　姬氏染液(Giemsa's stain)加温染色法：(1)姬氏染液的配制：按常规方法(中山医学院，1979)配制姬氏染液。(2)染色方法：将姬氏染液与pH值7.0的缓冲蒸馏水以1∶15的比例稀释混匀后进行染色，将染色缸置入37℃水浴箱中，加温染色40～60min，以加强虫体对染液的渗透力。然后用蒸馏水冲洗晾干后，用加拿大胶封片。

　　2　结果和讨论

　　(1)将三N培养基由试管培养法改为小平皿培养法的优点是：如培养基有污染时，还可挑取尚未污染处的虫落做传代和染色用，不需要重新培养，即省时又省料。同时用直接接种法培养可减轻液体对琼脂的浸泡，从而减少了制片时琼脂碎片的残留。

　　(2)用此染色法制做的前鞭毛体标本片，片面干净，虫体形态完好，内部结构清晰，鞭毛体的细胞质呈浅蓝色，细胞核、基本和鞭毛为红色、杆状的动基体为紫红色，而且不易褪色，如果保存在标本盒内不见阳光，10余年后仍完好如初。由于未经离心，前鞭毛体的鞭毛不易被折断，集结在一起的前鞭毛体也不易被冲散，而保持了其菊花状的自然状态。

参考文献

　　1，中山医学院，编.1979.人体寄生虫学(第1版).北京：人民卫生出版社，314，348.