疟原虫基因转染的研究进展

　　随着恶性疟原虫（Plasmodium falciparum,P.f）2号[1]、9号[2]和3号[3]染色体序列的相继明了，关于P.f基因组的研究大大向前迈进了一步，在未来的2～3年内，将有可能对其全部基因组序列分析完毕。毫无疑问，疟原虫研究即将或已经进入后基因组时代[4]。对疟原虫各种基因及其基因产物的功能研究是发现有效疫苗和抗疟药物作用靶位的必要前提，但许多基因的功能，尤其是与疟原虫致病力有关的重要基因的功能尚未得以阐明，因而影响了疟疾的防治工作。以往的基因功能研究局限于与已知功能基因的比较和间接地推测，近年来发展的疟原虫基因转染技术[5]可通过改变基因后观察表型变化在活体研究基因的功能，使疟原虫基因的研究现状大为改观。不仅如此，该技术也使疟原虫基因表达调控、药物抗性研究、细胞生物学以及疫苗的研究均出现了崭新的技术性变化。在四种感染人的疟原虫中，P.f的致病性最为严重，其研究历来倍受重视，本文就疟原虫（主要是P.f）基因转染方面的研究作一综述。

　　1　疟原虫基因转染的种类

　　1.1短暂转染

　　自70年代末Hinnen等[6]建立酵母转染技术以来，真核细胞的转基因技术在基因调控和基因功能的研究中起到了极其重要的作用。1993年Goonewardence等[7]首先进行了疟原虫基因转染开创性的工作，为疟原虫基因转染技术的不断发展和广泛应用奠定了基础。作者将虫荧光素酶（firefly luciferase）基因插入鸡疟原虫（Plasmodium gallinaceum,P.g）有性期基因pgs28的编码区，构成嵌合基因后克隆入质粒载体pUC13，以电穿孔法导入P.g的雌配子和受精的合子，24小时后检测到虫荧光素酶的短暂表达。两年后，Wu等[8]报导了P.f环状体的短暂转染。将外源氯霉素乙酰转移酶（chloramphenicol acetyltransferase,CAT）基因分别置于P.f 热休克蛋白86（heat shock protein 86,HSP86）的5’和3’侧翼序列，或富组氨酸蛋白3（histidine-rich protein 3,HRP3）的5’侧翼序列和HRP2的3’侧翼序列等基因调控序列的控制下，也检测到外源CAT在P.f的短暂表达。

　　短暂转染常用于基因调控的快速分析，通过报告基因的转录表达即可分析调控基因在基因表达调控中的确切作用。但在很多方面的研究和应用中稳定转染是必需的。

　　1.2 稳定转染

　　与短暂转染不同，稳定转染（或转化）后将由于外源DNA的表达导致细胞表型的永久改变。

　　1.2.1 附加体型的稳定转染

　　一般而言，以环状质粒进行转染主要导致附加体的自我复制。在有药物作用时，环状质粒可以附加体的形式稳定存在（若延长给予高浓度药物作用，部分质粒可与受体细胞基因组整合）；当去除药物作用时，附加体将由于随机分离而不稳定，并在细胞分裂中丢失[9～12]。所以，这种“稳定”是相对的、有条件的。

　　van Dijk等[11]转染伯氏疟原虫（Plasmodium berghei,P.b）裂殖子时发现，在药物作用下质粒在受体细胞内以环状、非重组型附加体进行复制，虽然每个细胞中质粒拷贝数可高达15个，但未发现质粒与基因组的整合。

　　1.2.2 整合型的稳定转染

　　在van Dijk等转染P.b之后，Wu、Crabb、Vanderwel等分别对P.f和P.k进行转染，均得到了稳定的整合型转染子[10、12、13]。尤其在1997年，Crabb等[14]构建了一系列具有CAT基因和鼠弓形虫(Toxoplasma gondii,T.g)的二氢叶酸还原酶胸苷合成酶(dihydrofolate reducease-thymidylate synthase, DHFR-TS)双功能基因的变异体[乙胺嘧啶(pyrimethamine,pyr)抗性相关酶]、但定位方式不同的质粒载体，转染P.f环状体再以pyr筛选以获得稳定的转染子，并系统地分析了不同的启动序列和终止序列对外源基因表达的影响，使疟原虫稳定转染技术趋于成熟，为进一步研究疟原虫生物学特别是基因功能打下了坚实的基础。

　　2 疟原虫基因转染的方法学

　　2.2.1 疟原虫转染载体的主要构件

　　 用于疟原虫转染的载体根据不同的用途包含的构件有所差异，其中主要的有调控序列、报告基因和筛选标记。

　　基因转染中阳性转染子的筛选依赖于载体中选择基因的表达，而选择基因的表达又依赖于其侧翼区的调控序列。在疟原虫的基因转染中，该调控序列可以是同（种）源或异（种）源的，包括5’区和3’区，前者提供启动子和5’非翻译区(untranslated region，UTR），后者提供3’UTR和转录终止信号。用于P.f的调控序列有：CAM的5’和3’、Pf DHFR-TSR 的5’、P.chabaudi的DHFR-TSR 5’、HSP86的5’、HRP3 的5’、P.f增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）的5’和HRP2 的3’ [12]。

　　van der Wel等[13]采用完全异源的调控序列（源于P.f或P.b的启动子）和筛选基因（T.gDHFR-TSR或P.b DHFR-TSR）构建的载体转染P.k获得成功，表明这三个疟原虫种具有共同的基因表达调控信号。

　　报告基因的表达产物，往往具有便于测定的酶活性、直接或间接荧光等特性。通过对其产物活性的测定可以推知报告基因的表达强度，进而对表达调控的某种（些）因素获得一定的认识。好的报告基因应具有方便、可靠、敏感、线性、简单和动态等几个特点。目前应用于疟原虫转染的报告基因有：虫荧光素酶[7]、CAT[8]、绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)[14～17]，其中后两者已在P.f表达成功。CAT的活性需要14C氯霉素或3H乙酰辅酶A和液闪计数仪进行定量，但对于大多数研究者而言，废弃同位素的处理受到严格的限制。虽然已经出现了CAT的荧光分析，但尚未得到普遍应用。最近发现GFP可以作为真核细胞报告基因[18]，因其众多的优点（不加任何底物紫外线激发后就能产生荧光，荧光性质稳定，分子量小，对细胞没有毒性，使用方便，可进行活细胞实时定位观察）而被称为“活细胞的分子探针”[19]（也可利用GFP的荧光特性通过流式细胞仪筛选阳性转染子），在生命科学研究中得到了广泛的应用，是研究活细胞生命现象的新途径。

　　目前在疟原虫转染中DHFR-TSR是最常用的也是最好用的抗性筛选基因，它可置于各种同源或异源调控序列下进行表达[20]。DHFR-TSR可以是源于疟原虫的，也可以是源于T.g的，而一般后者作为筛选基因更好，因为它不但可减少与内源DHFR-TS的重组机率，而且可赋予转化子较高的pyr抗性。体外研究表明，含T.gDHFR-TSR的P.b转化子与含P.bDHFR-TSR的P.b转化子相比，前者对pyr的抗性水平比后者高10～100倍。当两种共转染入P.k后，含T.gDHFR-TSR的转化子在体内优先被选择[9、13、20]。

　　最近，Mamoun等[21]报导了两个可用于P.f转染的新的筛选基因：bsd和neo。前者编码土曲霉的blasticidin s 脱氨酶，对blasticidin S具抗性；后者编码转座元Tn5的新霉素磷酸转移酶Ⅱ，对geneticin即G418有抗性。但一些容易引起抗药性的药物则不能用于药物选择。

　　2.2 转染方法

　　目前在所有疟原虫的转染中主要采用电穿孔法。其原理是在高电压电场的作用下，细胞表面会形成临时性的微孔，外面的DNA分子即可进入细胞。所以，电穿孔技术实际上是一种物理学手段，而不是生物化学技术。不同种的疟原虫在电转染时的条件有所不同，P.f的转染条件为：2.5kV，25μF，200Ω，4mm电转杯（Bio-Rad） [8、9]，或0.31 kV，960μF，0.2mm电转杯[22]。

　　2.3 转染效率

　　VanWye等[23]根据其P.f的转染实验首先估计疟原虫电穿孔法短暂转染的效率为10-2数量级，且可有10倍左右变化。曾有P.f1%的转染率，但在大多数实验室仅为10-6。与P.f相比，弓形虫（Toxoplasma）的转染率较高，可达存活虫数的5%。利什曼原虫（Leishmania）的转染率也仅为10-4。 dan Goldberg使用SuperfectTM (Qiagen)使P.f的短暂转染率提高到5%-10%[4、24～26]。疟原虫转染时外源基因必须依次通过宿主红细胞膜、含虫空泡膜、疟原虫自己的细胞膜和虫体细胞核膜，因此，与其他真核细胞的基因转染相比，疟原虫的基因转染效率必然要低得多。

　　2.4 转染子的鉴定

　　转染后必须鉴定出阳性转染子才可对特定基因的功能进行相应的各项检测。附加体型转染子可通过PCR、Southern杂交和质粒回收实验，具特异性位点整合的DNA可通过PCR和Southern杂交得以鉴定。此外，整合型转染子也可以用脉冲场凝胶电泳法分离疟原虫的14条染色体后的染色体分析来鉴定。质粒回收也可确认整合的发生及恢复基因组中整合位点的侧翼序列[9]。

　　3 疟原虫基因转染的应用

　　3.1 基因表达调控

　　如前所述，短暂转染多用于基因表达调控的研究。Crabb和Cowman[12]以CAT作为报告基因，逐渐删除其5’侧翼序列，对PfCAM、PfDHFR-TSR和PfDHFR-TSR的启动子进行分析，确定了维持高转录活性的最小区域和含有重要启动子成分的小序列，为以后质粒载体的构建提供了必要的条件。

　　有人以虫荧光素酶为报告基因对P.g动合子表面蛋白pgs28的5’非编码区进行分析时发现，随着序列的缩短，蛋白的期特异性表达转为非期特异的连续表达，表明被删除部位含有期特异性表达元件[24]。最近，Dechering等[27]又对P.f有性期特异性基因pfs16和pfs25的启动子进行了分析，并发现了一种与其启动子相作用的反式作用因子蛋白。这是首次对P.f的基因调控过程做细致的研究。

　　3.2 基因功能研究

　　疟原虫转染技术在基因功能研究方面的应用主要是基因敲除[5、28]。其原理是：利用活细胞基因组DNA可与外源性DNA同源序列重组的性质，对预先选择的目的基因进行定点修饰以达到改变基因组某一特定基因的目的。

　　在基因敲除研究中，最为引人注目的是对环子孢子蛋白(circumsporozoite protein,CSP)[29]、血小板反应素/血小板凝血酶敏感蛋白相关未名蛋白(thrombospondin related anonymous protein , TRAP)[30]和结节相关富组氨酸蛋白(knob associated histidine rich protein, KAHRP)[31]的敲除，通过敲除发现了这些蛋白出乎预料的功能。例如，敲除KAHRP后，P.f失去形成结节的能力，恶性疟原虫红细胞膜蛋白1（Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1, PfEMP1）的定位也有改变，表明KAHRP在结节的形成、PfEMP1的组织及细胞粘附中具有重要地位。

　　3.3 药物研究

　　特异性药物靶蛋白的过表达是药物抗性机制中比较普遍的一种，转基因表达可在实验条件下模拟重组虫体中药物靶蛋白的过表达，并分析其过表达的可能机制。也可用表达性载体构建疟原虫的cDNA文库后转入疟原虫，然后以药物从中筛选相应的药物抗性虫株，再通过质粒回收从该虫株分离出可能的抗药基因[9]。

　　敲除虫体内某一可能的药物靶蛋白基因，观察该蛋白在生活史中的作用，如果其作用必不可少，则可将该蛋白的抑制剂作为抗该虫的药物进行开发[28、32]。

　　3.4 疫苗研究

　　早期研究表明，减毒活虫疫苗可诱发机体有效的抗体免疫反应，但由于其有致病的可能性而不能作为疫苗。可利用基因转染敲除与疟原虫致病有关的某些基因，同时保留与疟原虫增殖能力和免疫原性有关的基因，从而保证了减毒活虫疫苗的安全性，为发展减毒活虫疫苗提供了一个新的方法。利用该方法制成的利什曼原虫减毒活虫疫苗安全性好，且可诱导完全的保护性免疫[33]。此外，疟原虫转基因技术对各种侯选疫苗抗原进行细致的分析必然促进疟疾疫苗的研制。

　　3.5 细胞生物学研究

　　疟原虫分泌性蛋白的转运、裂殖子入侵、重症疟疾中的细胞粘附、疟原虫与宿主之间的关系、var基因的变异以及不同发育期rRNA基因转换的调节等细胞生物学都可用基因转染技术来研究。有人将GFP基因与烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV）的移动蛋白(movement protein，MP)基因融合来跟踪MP在亚细胞间的移动，监测MP分子与宿主蛋白的关系，分离与之相互作用的成分[34]。同样，可将GFP与疟原虫某分泌性蛋白基因融合，转染疟原虫以GFP作为可读性标记观察该蛋白的转运过程。

　　4 存在的问题

　　疟原虫的基因转染是新近发展起来的一项新技术，已应用于很多方面的研究，但仍有一些问题需要寻找解决的办法。

　　基因敲除可为基因功能研究提供重要的信息，但这种信息只是“全或无”的。对于双倍体哺乳类细胞的重要基因来说，在敲除后尚可通过对其胚胎的研究得到很多信息，但对于在生活史大部分阶段均为单倍体的疟原虫而言，具重要功能的基因敲除后将导致虫体死亡而无法研究。如被敲除基因的功能可以被其他基因所替代，则会影响对该基因确切功能的阐述。另外，对于多拷贝基因的完全敲除非常困难。

　　疟原虫转染技术最重要的应用就是基因敲除，但由于上述缺点迫切需要建立可诱导性转基因系统。目前认为四环素抑制子（tetracycline repressor,TetR）系统是最符合逻辑和最有前途的诱导性系统，该系统已在寄生原虫锥虫[35]和阿米巴[36]成功建立。其原理是调节基因表达的TetR与四环素抗性操纵子的调控序列结合，使RNA聚合酶不能与启动子结合，抑制下游结构基因的表达，当不同浓度的诱导物（四环素或其类似物）存在时，可不同程度地与TetR结合，使结合有四环素的TetR不能与调控序列结合，从而不同程度的开启结构基因的表达。

　　此外，疟原虫基因转染的效率有待于进一步提高。

　　作者单位：第四军医大学病原生物学教研室 西安 710032

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