第三节动脉血管壁细胞间质成分的提取

第三节　动脉血管壁细胞间质成分的提取

　　一、胶原的提取

　　动脉血管壁胶原提取的基本方法是，首先除去凝血等其他杂质，由于胶原为杆状三螺旋结构，能耐受胃蛋白酶的作用，但是两端球蛋白结构能被胃蛋白酶水解。胶原纤维内分子间的共价交联是由分子末端赖氨酸或羟赖氨酸形成，用胃蛋白酶切断末端交联结构，使胶原分子的巨形结构被破坏，从完整分子可提出各种类型的胶原。

　　（一）胶原的初步分离

　　1．小心取出动脉血管，用0.05mol/L BPS pH7.8洗净凝血块，3kr/min离心10min。

　　2．冷丙酮酸浸泡24h除去脂肪，蒸馏水洗涤3次。

　　3．将组织破碎，加三倍体积组织匀浆处理液（0.5mol/L乙酸，pH2.5，1%胃蛋白酶）于4℃48h,16kr/min离心45min，同样方法重复3次。

　　4．向留取的上清液中缓缓加入NaCl，最终达到4mol/L浓度，搅拌12～24h，15kr/min离心45min，弃上清。

　　5．进一步分离各种胶原可用分段盐析和柱层析法进行操作。

　　（二）胶原的分段盐析

　　1．取初级提取物加0.1mmol/L乙酸，加NaCl至0.7mmol/L，15kr/min离心20min。沉淀提取Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原，上清提取Ⅳ、Ⅴ型胶原。

　　2．沉淀，加0.14mol/L PBS pH7.6,37℃保湿16h，10kr/min离心20min，上清液加NaCl至4mol/L，离心，沉淀物为Ⅳ型胶原。

　　3．1mol/L NaCl溶解沉淀，加3倍体积Tris-HCl pH7.4，10kr/min离心20min，沉淀为Ⅲ型胶原。

　　4．上清加NaCl至2.5mol/L,10kr/min离心20min，沉淀为Ⅰ胶原。

　　5．取1.操作的上清加NaCl至1.2mol/L,15kr/min离心20min。

　　6．沉淀溶于4倍体积1.0mol/L NaCl、0.05mol/l Tris-HCl pH7.4，加NaCl至4mol/L 10kr/min离心20min。

　　7．上清加NaCl至4mol/L，调pH到3.5,离心得沉淀再加5倍体积0.2mol/l NaCl、1mol/L脲、0.01mol/L Tris-HCl pH7.4的DEAE液悬浮16h，小心取上清加NaCl至4mol/L，10kr/min离心10min，沉淀为Ⅳ型胶原。

　　8．将6.沉淀部分加0.2mol/L NaCl,10.05mol/l Tirs-HCl pH7.4的DEAE悬浮16h，上清加NaCl至4mol/l,10kr/min离心10min，沉淀为Ⅴ型胶原。

　　（三）将初步提取的胶原加到DEAE纤维柱上，用0.2mmol/l NaCl、0.05mol/L Tris-HCl pH7.5的溶液洗脱，230nm波长检测洗脱物。因为胶原在pH7.5时均带正电荷，不与DEAE柱结合，所以被柱结合的则为非胶原蛋白。

　　二、蛋白多糖的提取

　　蛋白多糖具有可溶于4mol/L盐酸胍的性质，再经DEAE-纤维素层析除去其他杂质，非蛋白多糖与蛋白多糖用不同浓度尿素可分段层析分开。

　　1．取动脉血管小心除去血管周围脂肪组织和纤维膜，用冷0.5mol/l PBS pH7.8洗涤，2kr/min离心10min。

　　2．用匀浆器破碎，加入15倍体积的提取液（0.05mol/L乙酸pH5.8、4.0mol/L盐酸胍、0.1mol/l 6-氨基乙酸EDTA、3mol/L苄脒），于4℃缓慢振荡24h，10kr/min离心30min。

　　3．取上清透析浓缩30倍。

　　4．将提取液加入已经平衡好的DEAE-纤维素柱上，分别用0.15mol/l NaCl和2mol/LNaCl洗脱，均用280nm波长紫外监测仪连续监测。

　　三、弹性蛋白的提取

　　提取方法较多，各有优缺点。1969年Bornstein和Ross先用5mol/L盐酸胍抽提，再用胶原酶水解其他非弹性蛋白组分，最后还原二硫键，分离提取弹性蛋白。具体方法如下：

　　1．将动脉血管壁洗净，小心除去附着结缔组织。

　　2．将血管壁组织浸于4℃ 50%的吡啶液，破碎组织，3kr/min离心15min。

　　3．取沉淀用蒸馏水洗涤3次，真空干燥后研成粉末。

　　4．将粉末悬浮于2mol/L NaCl,4℃搅拌24h，3kr/min离心20min，弃上清，沉淀用蒸馏水洗3次。

　　5．将沉淀用无水乙醇脱脂20min，用氯仿-甲醇（2：1）处理20min，再用乙醚冲洗干燥，3kr/min离心20min，真空干燥沉渣。

　　6．干燥的沉淀物用5倍处理液（0.5mol/L CaCl2、10.05mol/l Tris-HClpH7.5、2%胶原酶）洗涤，3kr/min离心20min。

　　7．将沉淀移入带塞的瓶中，加含0.5mol/L盐酸胍、0.1mol/l Tris-HClpH8.5、0.05mol/L二硫赤藓糖醇，2.0mol/L EDTA液4℃过夜。

　　8．3kr/min离心20min，沉淀用蒸馏水洗涤2次。

　　9，沉淀物加入处理液（6mol/L尿素、0.1%SDS、0.05mol/L二硫赤藓糖醇、0.05mol/l Tris-HCl pH7.7），通过氮氧真空过夜，3kr/min离心20min。

　　10．沉淀再真空干燥，即为弹性蛋白。

　　四、粘连蛋白的提取

　　提取粘连蛋白的基本原理是用NaCl脱氧胆酸钠液提取血管壁中的粘连蛋白，再用高盐除去杂质，然后进一步用Sephacryl层析纯化，方法如下：

　　1．将动脉血管壁组织加10倍体积处理液（0.05mol/l Tris-HCL pH7.6、0.5%核酸酶），4℃搅拌20min，10kr/min离心10min。

　　2．沉淀用含0.05mol/L Tris-HCl pH7.6、0.5%PMSF、10%甲醇液，洗涤2次，10kr/min离心10min。

　　3．沉淀物中，加40倍体积处理液（0.05mol/l Tris-HCl pH7.6、0.5%PMSF、0.5mol/L NaCl,）4℃过夜后，10kr/min离心10min。

　　4．上清用PEG6000浓缩，最后加入已平衡好的Sephacryl S-3000层析柱上，用0.05mol/L Tris-HCl pH7.6、0.5%NaCl洗脱，第一峰即为粘连蛋白。