第二节动脉血管壁细胞组分的提取

第二节　动脉血管壁细胞组分的提取

　　一、血管壁细胞提取

　　1．以无菌术取动脉，立即放入4℃、5%水解乳蛋白Hanks液中漂洗，除去凝血。

　　2．用小镊剔除外膜纤维、脂肪组织，用剪子沿血管壁纵向剪开血管，用Hanks液洗2次。

　　3．可先分开内皮细胞和平滑肌细胞，也可不区分两类细胞，将血管切成小块，放入2%胶原酶，温浴12～18h。

　　4．制备不同梯度液，收集血管细胞常用梯度液为呲咯烷酮（precoll）。梯度液选择40%～70%，40%梯度液应是4份precoll、1份小牛血清、5份BPS，其他浓度配制与此相同。

　　5.把密度梯度液按从管底至管口密度梯度逐渐减少的顺序铺入试管，将操作3.细胞液铺于顶层，4kr/min离心，收集各层细胞鉴定。

　　二、细胞核提取

　　1．取制备血管细胞悬液放于试管中，加五倍体积缓冲液（10mmol/l Tris HCL,pH7.4含10mol/L NaCl,1.5mmol/L Mgcl₂），加1%SDS10 μl用匀浆器轻轻匀浆。

　　2． 加蔗糖液（0.34mol/L,蔗糖10mol/L MgCl₂）2份再匀浆1次，下面铺一层0.88mol/L蔗糖，800g离心5min，收集沉淀部分。

　　3．在0.88mol/L蔗糖液中再纯化1次，然后将细胞悬于10ml蔗糖液(0.34mol/L0.05mmol.LMgCl₂)液中，用超声波处理10S。

　　4．将两倍体积的0.88mol/L蔗糖加于上述处理液中，800g离心30min收集沉淀部分。

　　5．将沉淀加入0.88mol/L蔗糖，5kg离心1h，沉淀部分为细胞核，将其保存于0.25mol/L蔗糖，0.55mmol/LMgCl中备用。

　　三、细胞膜的提取

　　1．取一定量酶处理的细胞，用匀浆器破碎，操作要温和，使细胞膜保持完整。由于水与膜的疏水部分之间有反应，因此要精确掌握分离介质中的离心强度和渗透压，以每克细胞湿重加40ml介质。

　　2．用Potter-Elvehiem匀浆器，杆与壁间间隙0.5～0.6μm,14.4kr/min上下匀浆4～6次，每次5S。

　　3．过滤匀浆液，150g离心10min，保留上清，沉淀部分加入50μl介质，用匀浆器1kr/min匀浆3次，150g离心10min，沉淀部分再加入上次匀浆的上清液。

　　4．合并3次上清液，2kg离心10min，弃上清，沉淀部分溶于100μl介质，离心10min，弃上清，留沉淀。

　　5．将沉淀部分加入70%蔗糖15份，然后分别置于三个离心管中，上面依次叠加54%、49%、45%，41%，37%蔗糖溶液各2、2、5、5、3份。

　　6．700kg离心90min，分离介质在1.16～1.18之间形成介面。

　　7．收集d为1.16～1.18g/ml之间的细胞膜，加30倍的介质以2.5kg离心10min，洗涤2次。

　　8．保存于2.7mmol/L Tris-HCl pH7.5缓冲液中，用于细胞膜的研究分析。

　　四、溶酶体的分离

　　1．在梯度混合器的两个小杯中分别加入2.1mol/L和1.1mol/L蔗糖（比例9：1）。

　　2．收集血管壁细胞，用特制匀浆器1kr/min匀浆10次。

　　3．以150g离心10min，上清液以同样条件离心1次，弃沉淀，上清液以9kg离心3min弃上清液，

　　4．沉淀分三种不同颜色，褐色为半纯化的溶酶体，中间黄褐色为线粒体部分，上层白色为膜成分混合物。首先小心吸取上层，然后加入0.3mol/L蔗糖数毫升，慢慢摇匀使界面层悬浮，再用0.3mol/L蔗糖洗1次。

　　5．将悬浮的半纯化溶酶体铺在梯度平面上，用玻棒搅匀最上层梯度液，使溶酶体和梯度液之间的介面破坏，然后以10kg离心15min，离心后可出现三条明显的区带及少许沉淀，最下面黄褐色为纯化的溶酶体，中间黄色的为线粒体。

　　五、线粒体的分离

　　1．浆分离的血管浸入缓冲液（250mmol/L甘露醇、0.5mmol/l EDTA、 5mmol/L Hepes、0.1%BSA、pH7.4）匀浆破碎细胞，600g离心5min，除去细胞核及碎片。

　　2．上清液在100kg离心10min，留取沉淀部分。

　　3．将沉淀部分悬浮于5ml操作1.的缓冲液中，加入5倍体积30%Percon、225mmol/L甘露醇、1mmol/L，EDTA、25mmol/L Hepes 0.1%BSA,5000g离心30min。

　　4．将上述沉淀溶于适量10mmol/L KH₂PO₄，pH7.4中，轻轻振荡15min。

　　5．加入10ml蔗糖液缓冲液（32%蔗糖、30%甘油、10mmol/l MgCl₂、10mmol/L KH₂PO₄，pH7.4）振荡15min。

　　6．用BransonB-12超声波碎仪60～70W处理2次，每次15min，12kg离心10min。

　　7．将沉淀部分溶于10倍体积缓冲液中并铺于试管底层，试管中层铺成不连续蔗糖梯度（25.3%、37.9%和51.3%）蔗糖各4mm厚，上层铺上清液。

　　8．2kg离心3h，在25.3%/37.9%界面处为线粒体外膜，在51.3%蔗糖层分别回收内膜和基质。