第二节T细胞功能的检测

第二节　T细胞功能的检测

　　T细胞具有多种生物学功能，如直接杀伤靶细胞，辅助或抑制B细胞产生抗体，对特异性抗原和促有丝分裂原的应答反应以及产生细胞因子等，据此建立了一系列的检测方法，其中有些已用作临床检测细胞免疫功能的指标。

　　一、T细胞增殖试验

　　本试验又称T细胞转化试验。T细胞在体外经某种物质刺激，细胞代谢和形态相继发生变化，主要表现为短时间内细胞表面电荷即起变化，数小时后细胞内酶活化，在24～48h细胞内蛋白质和核酸合成增加，从而产生一系列增殖的变化，如细胞变大、细胞浆扩大、出现空泡、核仁明显、染色质疏松、淋巴细胞转变成母细胞（图21-2）。因此，种淋巴细胞增殖又称淋巴母细胞转化（lymphoblasttransformation）。淋巴细胞增殖反应既可通过形态学观察计数，也可用³H-TdR掺入法检测细胞内DNA合成量的增加，据此判断出淋巴细胞对有关刺激的反应性与功能状态。

图21-2 淋巴细胞转化的形态特征

　　体外引起淋巴细胞转化的刺激物种类很多，可分为非抗原性刺激物和抗原性刺激物两类。

　　1．非抗原性刺激物如植物血凝系（phytoagglutinin，PHA）、刀豆素A（concanavalinA，ConA）、美洲商陆（pokeweedmitogen，PWM）和脂多糖（LPS）等，通称促有丝分裂原（mitogen）。其中LPS刺激B细胞，PWM可刺激T和B两类细胞，PHA和ConA刺激T细胞增殖。

　　2．抗原性刺激物如破伤风类毒素、链球菌激酶、纯化蛋白衍生物（purifiedproteinderivative，PPD）和白色念珠菌等。同种异型组织抗原也可作为刺激物，例如HLA，用混合淋巴细胞培养法观察器官移植中受体细胞对供体细胞的反应性实质上也是淋巴细胞转化试验。

　　非抗原性刺激物可使正常人外周血中的淋巴细胞引起转化，与机体是否对某种抗原致敏无关，因此属非特异的淋巴细胞转化。抗原刺激物的作用只能使相应致敏的淋巴细胞发生转化，因此转化率大大低于非特异性转化。通常应用最多的刺激物是PHA，特异性抗原仅使已经相应抗原致敏的T细胞发生转化，转化率一般约5％～30％，而且需要培养4～5天。虽然T细胞对特异和非特异性抗原的识别过程不同，但被激活后，诱发的分裂和增殖过程却是相同。因此根据非特异性促有丝分裂原激活T细胞增殖反应的程度，同样可推测T细胞识别特异性抗原增殖反应。淋巴细胞转化试验是判断T细胞功能的一项常用的非特异性体外免疫学检测指标。

　　该试验有形态计数法和同位素计数法两种。

　　（一）形态法

　　其原则是将外周血液或分离的单个核细胞与适量的PHA混合，置37℃培养72h，取培养细胞作涂片染色镜检。根据细胞的大小，核与胞浆的比例，胞浆的染色性和核结构以及有无核仁等特征，分别计数淋巴细胞、过渡型母细胞和核有丝分裂相细胞以及成熟的小淋巴细胞，以前三者为转化细胞，每份标本计数200个细胞，按下列计算转化率：

　　转化率＝转化的淋巴细胞数／（转化的淋巴细胞数＋未转化的淋巴细胞数）×100％

　　在正常情况下，健康人外周血经PHA刺激的淋巴细胞转化率为60％～80％，小于50％可视为降低。形态学方法简便易行，便于基层实验室推广采用，但判读结果受主观因素影响较大，有些细胞形态难以确认，因此重复性和可靠性较差。

　　（二）同位素法

　　绝大多数外周血中T细胞通常处于细胞周期的G₀期，受特异性抗原或促有丝分裂原激活后，从G₀期进入G₁期，并合成蛋白质、RNA和DNA前体物质等，为DNA复制准备物质基础，然后进入S期，细胞合成DNA量倍增，此时若在培养液中加³H标记的DNA前体(³H胸腺嘧啶苷，³H-TdR)，后者即掺入新合成的DNA中，根据掺入的多少推测细胞增殖程度。检测原则是将全血或分离的单个核细胞悬液加入含培养液的试管中，每份样品分实验管和对照管，实验管加最适量和亚适量PHA后，移置5％CO₂温箱37℃培养56h，加适量³H-TdR，继续培养16h，结束后将细胞收集在玻璃纤维膜上，递经处理，最后用液体闪烁器测量，记录每分钟脉冲数(cpm)，算出3个复管的均数±S。通常以刺激指数(SI)表示转化能力。

　　SI＝PHA刺激管cpm均值/对照管cpm均值

　　由于对照管组和刺激组实验条件一致，故用SI表示淋巴细胞增殖能力可以减少可变因素的干扰，但对照组同位素掺入量的增加或减少，能使SI发生明显变动，以致有时不能反映真实的增殖情况，因此最好同时参照对照组和实验组的cpm加以判断。值得强调的是目前配制的PHA多为最适浓度，在该条件下，功能略逊的细胞仍有应答能力。如同时采用最适和亚适浓度，一些细胞免疫功能较低的T细胞对亚适浓度的PHA则缺乏或仅呈极弱的应答，故在一定程度上可识别出应答功能较差的T细胞群。

　　二、T细胞介导的细胞毒试验

　　T细胞介导的细胞毒性（lymphocytemediatedcytotoxicity，LMC）是细胞毒性T细胞（CTL）的特性，凡致敏的T细胞再次遇相应靶细胞抗原，可表现出对靶细胞的破坏和溶解作用，它是评价机体细胞免疫水平的一种常用指标，特别是测定肿瘤CTL杀伤肿瘤细胞的能力，常作为判断预后和观察疗效的指标之一。该试验的原则是选用适当的靶细胞，常用可传代的已建株的人肿瘤细胞如人肝癌、食管癌、胃癌等细胞株，经培养后制成单个细胞悬液，按一定比例与受检的淋巴细胞混合，共温一定时间，观察肿瘤细胞被杀伤情况，常用方法如下：

　　（一）形态学检查法

　　淋巴细胞与肿瘤细胞混合共育后，以瑞氏染液着色，用显微镜计数残留的肿瘤细胞数，计数淋巴细胞抑制肿瘤细胞生长的抑制率：

　　抑制率％＝（对照组平均残留级肿瘤细胞数－实验组平均残留细胞数／对照组平均残留肿瘤细胞数×100％

　　（二）同位素法

　　一般采用¹²⁵I-UdR掺入法或⁵¹Cr释放法，以细胞毒指数或⁵¹Cr释放率表示T细胞的细胞毒活性。