第二节供者与受者的配合选择

第二节　供者与受者的配合选择

　　一、移植物选择标准

　　移植物选择是移植能否成功的关键因素之一，选择的标准可归纳为以下几类：

　　1．一般情况①移植物本身必须是健康细胞、组织或器官，在形态和功能上都没有异常发现；②供者无传染病（尤其是艾滋病和肝炎等）或相关感染、无代谢病和恶性肿瘤（原发性脑肿瘤除外），全身重要器官的功能正常；③供者与受者的年龄应相仿，尤其供者应小于受者；但在生命器官移植时，供者年龄最好在10～50岁之间；④供者器官与受区的大小应相接近，尤在心、肝、肺等原位移植中，供者与受者体重相差不能过于悬殊，否则就植入困难或者不适应。

　　2．ABO血型相容一般临床输血的ABO选配原则也适用于移植，O型受者只接受O型移植物；A型受者接受A型或O型；B型受者接受B型或O型；AB型受者接受范围较广。一般情况下，不管是活体移植物还是尸体移植物，血型不相容就不应该进行移植。

　　3．HLA相容性供者与受者之间HLA相同的位点越多，相容性就越好，长期存活的可能性就越大。但是临床移植的绝大多数是同种移植，在非直系血缘关系的人群中，几乎不可能发现HLA完全相同者；只要能发现1～2个HLA位点相同，就比HLA完全不相同者之间的移植成功率大得多。如果有可能，移植物的供者最好是近亲（例如父母、子女或同胞兄弟姊妹等）的健康志愿者，样可以在移植前对双方较全面的检测和交叉配合试验，还可能有选择的余地。如果等待尸体器官，检测HLA的困难性增加，选择的机会也少。移植中心的建立可以解决好多难题。

　　二、HLA血清学定型试验

　　HLA-A、B、C、DR或DQ位点的抗原可用血清方法进行检测，所以称为SD抗原（serologicallydefinedantigen），其检测方法普遍采用补体依赖的细胞毒（complementdependentcytotoxicyty，CDC）试验。

　　1．试验方法美国国家卫生研究院（NIH）的标准方法如下：将一系列已知特异性的标准分型血清（1μl/孔）按设计好的方案加到72孔或60孔专用反应板中（如暂时不用可以冰冻保存）；加入待检淋巴细胞2000个/1μl/孔，置室温30min让抗体与抗原结合；加入补体（多为家兔混合血清）5μl，置室温60min；每孔加入5％伊红2～3μl，使死细胞着色；3～5min后每孔加12％福尔马林8μl固定细胞；待细胞全部沉淀后用相差显微镜或倒置显微镜观察结果。某孔的着色细胞超过50个即为阳性反应，说明被检细胞的HLA型与该孔所加抗体的相一致；否则为不一致。

　　2．细胞分离检测活体可取外周血直接分离；检测尸体时取淋巴结，制成单个细胞并洗涤后再分离。检测HLAⅠ类抗原时取单个核细胞层的细胞即可应用，因为该层细胞都表达Ⅰ类抗原；但检测HLA-DR和DQ等Ⅱ类抗原时，就需要进一步分离较纯的B细胞（纯度达80％以上），因为Ⅱ类抗原不分布在T细胞上。

　　3．分型血清试验用的标准抗血清必须从经产妇（尤其多产妇）的血清中筛选，胎盘液或其他体液也可应用；也可通过人工免疫献血员的方法得到。筛选的方法也用CDC试验，只是将已知与待检互换。Ⅱ类抗血清筛选后还必须用混合血小板将其中可能含有的Ⅰ类抗体吸收去，因试验用的B细胞上也有Ⅰ类抗原。许多人尝试过抗HLA的单克隆抗体，但是多不成功，因鼠源性抗体主要是针对人类的公共抗原而非某个体的HLA私有抗原；还有一个原因是鼠源性抗体多不能固定补体，不能用细胞毒方法进行检测。

　　4．HLA定型板某些专门实验室将HLA定型血清预先加到专用的反应板上冰冻保存，可供自己或出售给他人使用，试验时只须加入待检细胞及其它试剂即可。定型板中抗血清的种类要覆盖本民族或本地区80％以上的抗原，其中高频抗原每种抗血清3份以上，低频抗原每种抗血清2份以上。定型血清板须经几个实验室认可或有关部门核准后才能销售和使用；现在国内所做的定型板多限于HLAⅠ类抗原的检测。

　　三、HLA细胞法分型试验

　　HLA-D和DP位点的抗原须用细胞法分型进行鉴定，所以又称LD抗原（lymphocytedefinedantigen），其鉴定方法普遍采用混合淋巴细胞培养（mixedlymphocyteculture，MLC），也称混合淋巴细胞反应（mixedlymphocytereaction，MLR）。

　　1．试验方法将分离的反应细胞（通常是的淋巴细胞）与刺激细胞（通常是供者或已知的标准淋巴细胞）配制成1×10⁶/ml浓度的悬液，各加0.2ml到反应管中；放置37℃和5％CO₂环境下培养5～6天。培养结束后进行涂片染色，观察并计数转化的淋巴细胞；也可在培养结束前5～12小时加入³H-TdR，收获后用液体闪烁仪计数细胞的放射性。试验结果的常用表示方式是刺激指数（SI）。

　　MLC分为双向法和单向法。双向MLC是反应管中两种细胞都有应答能力，可以互为刺激细胞和反应细胞，试验结果是两种细胞反应之和。

　　SI＝2×试验管cpm/（A对照cpm＋B对照cpm）

　　双向MLC只能反映两种细胞间LD的差别，结果比较模糊，也不能做LD抗原的分型。单向MLC是将刺激细胞用丝裂霉素C（mitomycinC）或X线照射先行灭活，但细胞的抗原性保持不变，因此可作为刺激细胞而不能作为反应细胞，试验结果是待检测细胞的反应，使于结果分析。

　　SI＝试验管cpm/自身对照cpm

　　单向MLC可以用来进行HLD-D和DP位点的分型试验，常用的方法有两类：纯合子分型细胞（homozygoustypingcell，HTC）试验和预敏淋巴细胞分型（primedlymphocytetyping，PLT）试验。

　　2．HTC试验HTC是指细胞内一对同源染色体上两个HLA单倍型完全相同，所以该位点在细胞表面只表达抗原；HTC可从近亲婚配的子代表中寻找。将一组HTC经处理来活后作为刺激细胞，与待检细胞做单向MLC。如果待检细胞与刺激细胞的LD不同，就会发生反应；如果相同便不反应；所以试验又称为阴性分型法。当SI≤2时可认为待检细胞与该管HTC的LD抗原相同。本法的缺点是HTC难以得到，而且培养时间长（5～6天），在尸体器官移植时不能应用。

　　3．PLT试验本方法需事先准备分型细胞：选择只有一个单倍型相同的两个体a/b和a/c（这在双亲与子女之间不难做到），取前者的淋巴细胞处理后作刺激细胞，取后者的淋巴细胞作反应细胞；将两者进行单向混合培养，至第10天使可得到针对b单倍型有特异性免疫应答能力的预致敏分型细胞（PTL）。依此类推，可以制备出一系列能识别各种已知LD抗原的一套PTL；这些处于休止状态的致敏记忆细胞可在液氮中长期保存备用。

　　进行PLT试验时，需将待检淋巴细胞处理成刺激细胞，而PTL为反应细胞；如果待检细胞的LD抗原与PTL预先识别的特异性相同，则PTL会迅速出现反应（二次应答），如不同则不出现快速反应，所以本法又称为阳性分型法。PLT法克服了HTC法试验周期长的缺点，在24小时内即可报出结果；PTL比HTC容易得到，但真正做起来也复杂。

　　不管是CDC试验还是MIC方法，都必须以受检者的淋巴细胞作为检测标本，这就大大地限制了检测方法的应用范围；而且还存在抗体来源困难、细胞培养周期过长等缺点；所以近年来将分子生物学技术引入了HLA检测的领域，产生了DNA分型法。DNA分型法是利用PCR技术将标本中的少量目的DNA大量扩增，然后再进行产物鉴定的方法（原理和步骤在此不予讨论），特点是灵敏度高，试剂来源容易，应用范围广，陈旧的或微量的标本都可进行检测，在移植医学、法医学和其他方面都有广阔的前途。

　　四、交叉配合试验

　　传统的交叉配合（crossmatching）试验是检测受者体内是否存在抗供者的特异性抗体，现在可同时检测受者对供者LD抗原的相容程度。不管是否已经进行过各种HLA分型试验，交叉配合试验对选择移植物都有一定的参考价值。

　　1．微量细胞毒试验用供者的淋巴细胞作靶细胞，与受者的血清进行CDC；出现阳性反应说明受者体内含有抗供者的特异性抗体，移植后很有可能发生超急排斥反应。若要明确受者的抗体是抗Ⅰ类抗原还是抗Ⅱ类抗原，可以将供者的淋巴细胞进一步分离出较纯的T细胞和B细胞分别进行检测；若要排除患者自身抗体的影响，可以用患者自己的细胞与自已的血清进行试验作为对照。

　　交叉配合是移值前必须做的一个检验项目；对一些曾经接触过移植抗原的受者，例如多次接受输血者、经产妇、有不成功移植史或接受过血清透析治疗者，尤其要进行审慎的检验。

　　2．流式细胞仪检测将供者淋巴细胞与受者血清共育后，用荧光标记的抗人Ig对结合有抗体的细胞染色，在流式细胞仪上进行荧光标记测定。该法比微量细胞毒法的灵敏度高100倍，有条件的单位可以优先考虑使用。

　　3．混合淋巴细胞培养将供者与受者的淋巴细胞做双向混合培养，或者灭活供者的淋巴细胞做向混合培养，细胞反应的程度与供－受者相容的程度呈负相关。

　　4．细胞介导的淋巴细胞毒试验检测受者对移植物可能发生的细胞介导的淋巴细胞毒作用（cell-mediatedlymphocytotoxicity，CML）。将受者淋巴细胞与灭活的供者淋巴细胞做常规单向MLC，收获致敏的受者淋巴细胞后，再与⁵¹Cr标记的、PHA刺激的供者淋巴细胞做CML试验；⁵¹Cr释放的程度与供－受者相容程度呈负相关。