第二节白细胞介素的检测

第二节　白细胞介素的检测

　　现已发现的白细胞介素（IL）多达10余种，兹举有代表性的几种IL检测法藉以举一反三。

　　一、IL-1的检测

　　IL-1有两种分子形式，即IL-1α和IL-2β，它们的生物学活性基本相同，均可采用生物学检测方法进行检测，若要区分IL-1α和IL-2β需用免疫学检测法。

　　（一）细胞增殖法

　　1．淋巴细胞增殖法IL-1具有淋巴细胞活化因子的活性，可以协同促有丝分裂原刺激T细胞或胸腺细胞发生有丝分裂，同时IL-1可以刺激T细胞产生IL-2或其它T细胞生长因子，并使之表达相应的受体。因此用细胞增殖法检测IL-1可有直接增殖法和间接增殖法两种。

　　（1）直接增殖法：IL-1在促有丝分裂原存在的情况下，能够促使胸腺淋巴细胞和某些体外建株的T细胞克隆生长，因此测定些细胞的增殖情况即可反映IL-1的活性。小鼠胸腺细胞测定法操作简单，比较常用，缺点是缺少特异性，因为IL-2亦可协同促有丝分裂原刺激胸腺细胞增殖。D10G4.1（小鼠T_H细胞克隆）测定法较胸腺细胞测定法的敏感性高，且D10G4.1对IL-2不敏感，因此特异性增强，缺点是需要长期饲养细胞株，该实验以³H-TdR掺入法或MTT法检测细胞增殖情况。通常IL-1浓度越高，细胞转化能力越强，IL-1浓度低于0.05ng/ml时，细胞转化能力接近促有丝分裂原单独刺激的程度。

　　（2）间接增殖法：某些品系小鼠的T细胞系只有在IL-1存在的条件下才能产生IL-2，并且IL-2的产生量与IL-1的浓度成直线关系。因此可以利用IL-2依赖细胞株（如CTLL2）测定IL-2，藉以间接测定IL-1的含量。

　　2．成纤维细胞增殖法IL-1能刺激成纤维细胞的增殖，故可利用来源于新生儿包皮或传代的人皮肤成纤维细胞（如CRL1445）测定IL-1。国内常用小鼠成纤维细胞瘤L929细胞株。

　　检测原则是将生长成单层的L929细胞用胰酶消化后，配成适当浓度的细胞悬液，继将不同稀释度的待测样本与L929细胞悬液分加入96孔培养液中。一式三份，并设置阴性对照，放入37℃、5％CO₂的温箱中温育72h，在第16h时加入适量³H-TdR，继续温育，结束后离心弃去培养上清，加入适量胰酶消化数分钟后，收集细胞测定cpm值或吸光度值。

　　（二）其他方法

　　1．骨和较骨组织测定法利用IL-1可诱导胶原酶释放，破坏软骨组织的特性，用分光光度计测定软骨硫酸盐释放量，即可间接椎知IL-1量。又如IL-1能影响骨质吸收，应用放射性⁴⁵Ca通过小鼠头顶骨系统吸收可测定IL-1活性，为骨质吸收释放法。

　　2．PGE₂测定法IL-1作用于下丘脑，诱导脑细胞合成前列腺素E₂（PGE₂），发挥致热原作用；还能诱导原代培养或建株传代的成纤维细胞产生PGE₂，故可用放免疫技术测定PGE₂藉以间接测定IL-1。

　　3．放射免疫测定法本法利用受检IL-1样品与碘标记IL-1竞争性结合Sepharose4B中抗IL-1抗体结合位点的原理而设计。该法敏感性较高，且可排除样品中其它干扰因素的影响，其特点是可以区分IL-1α和IL-1β。

　　4．体内测定法IL-1在体内可诱导发热、引起急性期蛋白合成及影响血中铁和锌水平。实验室多利用IL-1的致热原作用加以检测。在给动物静脉注射IL-1前后，以体温的升高幅度表示IL-1的活性，或定期测定血清中某些急性期蛋白的含量，如血清淀粉样蛋白A，血清淀粉样蛋白P等。

　　总之，由于IL-1的生物学活性比较广泛，其检测方法亦多种多样，但每种方法均有其缺点，往往需要结合使用。T细胞增殖法简便、易行且敏感，但样品中若混有IL-2，则可协同促有丝分裂原刺激T细胞增殖，从而干扰IL-1的测定。血清中的TNF同样可以刺激成纤维细胞的增殖，也可用成纤维细胞测定法，但特异性较差。放免法可排除其它因子的干扰，但此法仅测得IL-1的抗原性，不能完全代表其生物学活性。

　　二、IL-2的检测

　　IL-2的检测方法主要有两大类，一类是细胞增殖法，另一类是免疫学检测法。

　　（一）细胞增殖法

　　IL-2可刺激某些淋巴细胞增殖，根据细胞增殖情况可反映IL-2的活性，结果以U/ml表示。所用的IL-2反应细胞主要有CTLL、CTB6、F12、CTLL-2等小鼠IL-2依赖细胞株以及ConA活化的小鼠淋巴母细胞和小鼠胸腺细胞。这类细胞的增殖情况均可通过显微镜下直接计数、³H-TdR掺入法以及MTT法加以测定。

　　1．依赖性细胞株增殖法IL-2依赖细胞株在IL-2存在时才能生长，而对PHA、ConA等促有丝分裂原及IL-2以外的其它细胞因子均无反应。CTLL-2对IL-2的依赖性最强，表现为在单独培养时³H-TdR的掺入量低，而在IL-2存在时掺入值高，故为首选的靶细胞株。

　　2．T淋巴母细胞增殖法T细胞经植物血凝素激发转化为T淋巴母细胞，并表达丰富的IL-2受体，在体外IL-2存在时持续增殖，并与IL-2含量呈剂量依赖关系。

　　3．胸腺细胞增殖法IL-2可以增另ConA的促有丝分裂原作用而引起T血细胞大量增殖。将一定数量的小鼠胸腺细胞与亚刺激量的ConA和不同稀释的待检标本共育，在一定时间后检测IL-2增殖情况即能代表IL-2的活性。胸腺细胞增殖试验是目前检测IL-2活性最简便的方法。此法缺点是敏感性较差，如待测标本中存留有ConA会出现较强的非特异性反应等。

　　（二）免疫学检测法

　　根据抗原－抗体反应的原理，可利用抗IL-2的单克隆或多克隆抗体直接测定样品中的IL-2含量，结果用ng/ml表示。本法在rIL-2生产制备过程中可用以跟踪检测，在rIL-2基因克隆时亦可对阳性质粒进行初步筛选。

　　三、IL-3的检测

　　IL-3又名多能集落刺激因子（multi-CSF），在刺激多能造血干细胞及造血前体细胞的分化及增殖方面具有重要作用。目前检测IL-3的方法多根据其对某些IL-3反应性细胞促增殖及分化作用而设计。

　　IL-3能刺激多种细胞增殖，因此测定IL-3反应细胞的增殖情况即可反映IL-3的活性。目前常用于细胞增殖法的IL-3反应细胞有骨髓干细胞、骨髓来源的IL-3依赖株及肥大细胞等。此外，也可取小鼠胫骨和股骨骨髓细胞加受检样品，制成琼脂平板，置5％CO₂37℃温育1周后，计数集落形成数，凡细胞数等于或大于40～50个的细胞团块计为一个集落，根据形成集落数的多少判断IL-3的活性。

　　IL-3除刺激骨髓细胞增殖外，也能活化骨髓细胞使其释放组胺等生物活性物质。将小鼠骨髓细胞与不同稀释度的待检样品共温48h后，用荧光法检测培养上清中组织胺含量也能反映IL-3的活性。