第二十三章细胞因子和细胞粘附分子的检测--第一节细胞因子检测概

第二十三章　细胞因子和细胞粘附分子的检测

　　细胞因子和细胞粘附分子均在机体的免疫调节、炎症应答、肿瘤转移等生理和病理过程中起重要作用。检测类因子不仅是基础免疫研究的有较手段，亦是临床上探索疾病发病机制、判断预后和考核疗效的指标。

第一节　细胞因子检测概述

　　检测细胞因子的方法主要有生物学检测法、免疫学检测法和分子生物学检测法。

　　一、生物学检测法

　　生物学检测又称生物活性检测，是根据细胞因子特定的生物活性而设计的检测法。由于各种细胞因子具有不同的活性，例如IL-2促进淋巴细胞增殖，TNF杀伤肿瘤细胞，CSF刺激造血细胞集落形成，IFN保护细胞免受病毒攻击，因此选择某一细胞因子独特的生物活性，即可对其进行检测。生物活性检测法又可分为以下几类：

　　1．细胞增殖法许多细胞因子具有细胞生长因子活性，特别是白细胞介素，如IL-2刺激T细胞生长、IL-3刺激肥大细胞生长、IL-6刺激浆细胞生长等。利用这一特性，现已筛选出一些对特定细胞因子起反应的细胞，并建立了只依赖于某种因子的细胞系，即依赖细胞株（简称依赖株）。这些依赖株在通常情况下不能存活，只有在加入特定因子后才能增殖。例如IL-2依赖株CTLL-2在不含IL-2的培养基中很快死亡，而加入IL-2后则可右体外长期培养。在一定浓度范围内，细胞增殖与IL-2量呈正比，因此通过测定细胞增殖情况（如使用³H-TdR掺入法、MTT法等）鉴定IL-2的含量。除依赖株外，还有一些短期培养的细胞，如胸腺细胞、骨髓细胞、促有丝分裂原刺激后的淋巴母细胞等，均可作为靶细胞来测定某种细胞因子活性。

　　2．靶细胞杀伤法是根据某些细胞因子（如TNF）能在体外杀伤靶细胞而设计的检测方法。通常靶细胞多选择体外长期传代的肿瘤细胞株，利用同位素释放法或染料染色等方法判定细胞的杀伤率。

　　3．细胞因子诱导的产物分析法某些细胞因子可刺激特定细胞产生生物活性物质，如IL-2、IL-3诱导骨髓细胞合成胺、IL-6诱导肝细胞合成α1-抗糜蛋白酶等。通过测定所诱生的相应产物，可反映细胞因子的活性。

　　4．细胞病变抑制法病毒可造成靶细胞的损伤，干扰素等则可抑制病毒所导致的细胞病变，因此可利用细胞病变抑制法检测这类因子。

　　二、免疫学检测法

　　细胞因子均为蛋白或多肽，具有较强的抗原性。随着重组细胞因子的出现，可较方便地获得细胞因子的特异性抗血清或单克隆抗体，因此可利用抗原抗体特异性反应的特性，用免疫学技术定量检测细胞因子。尽管细胞因子种类繁多，只要获得了针对某一因子的特异性抗体（包括多克隆抗体或单克隆抗体）均可采用相似的技术开展工作。常用的方法包括ELISA、RIA及免疫印迹法。，几乎所有常见细胞因子的检测试剂盒均有商品供应。此外还可利用酶标或荧光标记的抗细胞因子单克隆抗体，原位检测因子在细胞内的合成及分布情况。免疫学检测法可直接测定样品中特定细胞因子的含量（用ng/ml表示），为大规模检测临床病人血清中细胞因子的含量提供了方便。本法仅测定细胞因子的抗原性，与该因子活性不一定相平行，因此要了解细胞因子的生物学效应，必须结合生物学检测法。

　　三、分子生物学方法

　　这是一类利用细胞因子的基因探针检测特定细胞因子基因表达的技术。目前所有公认的细胞因子的基因均已克隆化，故能较容易地得到某一细胞因子的cDNA探针或根据已知的核苷酸序列人工合成寡聚核苷酸探针。利用基因探针检测细胞因子mRNA表达的方法多种多样，常使用斑点杂交、Northernblot、逆转录PCR，细胞或组织原位杂交等。实验的关键在于制备高质量的核酸探针和获得合格的待测物（提取的mRNA样品或细胞/组织标本）。核酸探针是指一段用放射性同位素或其他标记物（如生物素、地高辛等）标记并与目的基因互补的DNA片段或单链DNA、RNA。根据其来源可分为cDNA探针、寡核核苷酸探针、基因组基因探针及DNA探针等。其中cDNA探针和人工合成寡核苷酸探针常用于斑点杂交及Northernblot，而RNA探针因穿透性好更适用于原位杂交。核酸探针技术的应用已经程序化，以cDNA探针为例主要包括：①质粒DNA的提取；②靶DNA片段的分离；③靶DNA片段标记；④待测样品mRNA的提取；⑤标记cDNA探针对待检样品的杂交；⑥放射自显影或显色分析。近年来出现的RT-PCR检测特异性mRNA的方法也广泛用于细胞因子研究领域。该法具有灵敏、快速等优点，甚至从1～10个细胞中就可检出其中的特异mRNA。

　　上述三种方法，各有优缺点，可互相弥补，在实际应用中，呆根据各自的实验目的和实验室条件进行选择。生物学检测法比较敏感，又可直接测定生物学功能，是最可靠的方法，适用于各种实验目的，是科研部门最常用的技术，但需要长期培养依赖性细胞株，检测耗时长，步骤繁杂，影响因素多，不容易熟练掌握。免疫学检测法比较简单，迅速，重复性好，但所测定的只代表相应细胞因子的量而不代表活性，同时敏感度也低生物活性检测法（约低10～100倍）。分子生物学法只能检测基因表达情况，不能直接提供有关因子的浓度及活性等资料，主要用于机制探讨。