冻干基因工程α2a干扰素制造及检定规程

发布：www.liulingling.com　来源：医学杂志

冻干基因工程α2a干扰素制造及检定规程

　　本品系用带有人α2a型干扰素基因重组质粒的大肠杆菌，经发酵培养及单克隆抗体亲和层析后精制而成。用于治疗某些病毒性疾病及部分肿瘤疾病。

　　1 菌种

　　1.1菌种来源

　　基因工程α2a干扰素工程菌由带有人α2a干扰素基因的重组质粒转化大肠杆菌而来。投产的工程菌需经卫生部批准。

　　1.2菌种特性

　　菌种表达稳定，表达水平符合投产菌种要求。

　　1.3制造用菌种库的建立

　　从原始菌种库传出，经扩大后冻干保存，或由上一代制造用菌种库传出，扩大后冻干保存作为制造用菌种库，但每次只限传三代。每批制造用菌种库均进行下列检定，合格后方可投产。

　　1.3.1划种LB琼脂平板

　　应呈典型大肠杆菌集落形态，无其他杂菌生长。

　　1.3.2涂片革兰氏染色

　　在光学显微镜下观察，应为典型的革兰氏阴性杆菌。

　　1.3.3对抗生素的抗性

　　应与原始菌株相符。

　　1.3.4电镜检查

　　应为典型大肠杆菌形态，并证明无支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染。

　　1.3.5生化反应

　　应符合大肠杆菌生物学性状。

　　1.3.6干扰素的表达量

　　在摇床培养，应符合原始菌种的表达量。

　　1.3.7质粒检查

　　应做该质粒的酶切图谱，并应与原始质粒相符。

　　1.3.8表达的干扰素型别

　　应用标准抗α干扰素血清做中和试验，证明型别正确。

　　1.4生产菌种

　　从制造用菌种库传出供生产用的菌种，称为生产菌种。

　　1.4.1生产菌种的制备及检定

　　取制造用菌种库冻干菌种开启后划种LB平板2～3块，培养后挑取平板中5～10个菌落，分别培养后保存，然后每个菌落分别进行干扰素表达量测定，至少重复一次，选出其中干扰素表达量最高的一份，供生产制备种子液用，其表达量应符合原始菌种的表达量。

　　1.5种子液

　　从生产菌种选出的菌种供做发酵用的称“种子液”。种子液的制备：将1.4.1项检定合格的生产菌种，根据实际需要做扩充传代，作为罐培养的种子液。

　　2 发酵培养

　　2.1空罐灭菌和实罐灭菌严格按照使用说明书要求操作。

　　2.2发酵培养基

　　应为适于发酵培养的培养基，根据菌种的抗生素抗性，培养若中允许加入少量抗生素，但应尽量避免含有β椖邗０防嗫股亍?/P>

　　2.3发酵培养参数

　　根据工程菌和发酵工艺要求设置和变换各项培养参数。

　　3 收集菌体

　　用离心法或其他适宜方法收集菌体，菌体可在?/FONT>20℃下保存1年。

　　4 菌体裂解

　　用盐酸胍或溶菌酶或高压匀浆泵等适宜方法裂解菌体。

　　5 制备粗制干扰素

　　菌体裂解后经离心所得上清液即为粗制干扰素。

　　6 纯化

　　粗制干扰素经单克隆抗体亲和层析等纯化步骤后即精制成“干扰素半成品原液”。

　　7 加白蛋白

　　取干扰素半成品原液检定合格后，立即另入适量人白蛋白保护剂，即为“加人白蛋白半成品”，保存于?/FONT>30℃。

　　8 稀释、除菌过滤

　　将“加人白蛋白半成品”用无热原生理盐水稀释至所需浓度，补加人白蛋白，使最终含量1%～2%。然后用0.22μm孔径滤膜除菌，除菌后抽样进行干扰素效价测定，热原质试验和无菌试验，合格后进行分装冻干。

　　9 分装、冻干

　　9.1 每支安瓿分装1ml，内含α2a干扰素100或300万IU。

　　9.2 冻干过程制品温度不得超过33℃。

　　9.3 冻干后成品置10℃以下干燥处保存，成品检定合格后进行包装。

　　10 半成品检定

　　每批半成品抽样进行10.1～10.8项检定。启开新菌种生产的前3批或生产条件有较大改变时进行10.9～10.12项检定。

　　10.1 效价测定

　　用细胞病变抑制法，Wish细胞/VSV为基本检测系统，用国家参考品校准为IU。

　　10.2 蛋白含量

　　用Lowry法测定。

　　10.3 比活性

　　应≥108Iumg蛋白。

　　10.4 纯度

　　10.4.1 电泳纯度

　　用非还原型SDS?/FONT>PAGE法，加样量不低于5μg，经扫描仪扫描纯度应在95%以上，聚合体不得超过10%。

　　10.4.2 高效液相色谱纯度

　　用280nm检测，应是一个吸收峰或主峰占总面积95%以上。

　　10.5 分子量

　　用还原型SDS?/FONT>PAGE法，加样量不低于5μg，α2a干扰素分子量应为19KD±10%。

　　10.6 残余外源性DNA含量

　　用同位素或生物素标记探针法测定，每剂量中残余外源性DNA应低于100pg。

　　10.7 残余鼠IgG含量

　　用酶标或其他敏感方法测定，每剂量（20μg）的鼠IgG含量应在100ng以下。

　　10.8 残余工程菌蛋白含量

　　用酶标或其他敏感方法测定，残余工程菌蛋白不得超过总蛋白的0.02%。

　　10.9 残留抗生素活性

　　半成品中不应有残余抗生素活性存在。

　　10.10 肽图测定

　　应符合α2a型干扰素图形，批与批之间图形应一致。

　　10.11 等电聚集

　　测定等电点，α2a型干扰素等电点应5.7～6.7范围内。

　　10.12 紫外光谱扫描

　　检查半成品的吸收光谱，批与批之间应一致，α2a干扰素的最大吸收光谱应为280±3nm。

　　11 除菌半成品检定

　　11.1 效价测定

　　同10.1项。

　　11.2 无菌试验

　　按《生物制品无菌试验规程》进行。

　　11.3 热原质试验

　　按《生物制品热原质试验规程》进行，注射剂量按家兔体重注射20万IU/kg，判定标准按该规程4.1项要求进行。

　　12 成品检定

　　12.1 外观

　　应为白色或微黄色疏松体，另入1ml灭菌注射用水溶解后，不得含有肉眼可见的不溶物。

　　12.2 pH值

　　pH值应为6.5～7.5。

　　12.3 效价测定

　　同10.1项。其效价应为标示量的80%～150%。

　　12.4 水分含量

　　应≤3%（g/g）。

　　12.5 鉴别试验

　　用中和试验法，其抗病毒活性能被抗α2a型干扰素血清所中和或用免疫印染法。

　　12.6 HBsAg检测

　　用敏感度为1ng/ml以下的试剂盒测定，应为阴性。

　　12.7 无菌试验

　　同11.2项，每批抽样不少于10支。

　　12.8 热原质试验

　　同11.3项。

　　安全试验

　　12.9.1 豚鼠试验

　　用体重300～400g豚鼠2只，每只腹侧皮下注射干扰素1ml，观察7天，局部无红肿、坏死、体重增加者为合格。

　　12.9.2 小白鼠试验

　　用体重18～20g小白鼠5只，每只腹腔注射干扰素0.5ml，观察7天，动物全部存活，每只体重增加判为合格。

　　13 保存与效期

　　保存于10℃以下干燥处。自效价检定合格之日起效期为2年6个月。

冻干基因工程α2a干扰素使用说明书

　　本品系用带有人α2a型干扰素基因重组质粒的大肠肝菌，经发酵培养及单克隆抗体亲和层析后精制而成。本品为白色疏松，每支含α2a型干扰素100万或300万IU，具有广谱抗病毒、抗肿瘤和调节机体免疫功能等生物学活性。用于治疗某些病毒性疾病，如两型肝炎、慢性活动性乙型肝炎、带状疱疹和尖锐湿疣等。对于毛细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、多发性骨髓瘤、T细胞淋巴瘤、表面膀胱癌和肾癌等均有良好疗效。

　　用法

　　每支用灭菌注射用水1ml溶解，通常根据病种确定给药方法、剂量、间隔和疗程。常采用皮下或肌内注射，尖锐湿疣亦可采用病损基底部注射。成人常用剂量每天1～3×10⁶IU，肿瘤可适当加大剂量。连日或隔日注射，疗程遵医嘱。

　　注意事项

　　1.使用本品后少数病人可发热或伴有寒战、头痛、乏力、肌痛、关节痛等流感样症状，常出现在用药的第一周，可在注射后48小时内消失。如遇有严重不良反应，须修改治疗方案或停止用药。

　　2.过敏者不可使用，严重心脏病患者、肾功能不良者、中枢神经系统功能紊乱者不宜使用。孕妇及小儿慎用。

　　3.一旦发一过敏反应，应立即停止用药，并给予适当的治疗。

　　4.本品溶解后为无色透明液体，如遇有混浊、沉淀现象，则不宜使用。

　　5.用注射用水溶解时应沿瓶壁注入，以免产生气泡，溶解后须于当日用完，不得放置保存，以免生物活性下降或污染。

　　保存

　　保存于10℃以下干燥处。

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