冻干精制人白细胞干扰素制造及检定规程

发布：www.liulingling.com　来源：医学杂志

冻干精制人白细胞干扰素制造及检定规程

　　本品系用特定的诱生剂诱导健康人白细胞，经提取后制成的冻干干扰素注射剂。用于某些病毒性疾病和肿瘤的辅助治疗，对免疫缺陷性疾病也有一定疗效。

　　1 制造

　　1.1制造要求

　　1.1.1白细胞

　　献血员供血应符合献血员体检及化验标准。一次供血不超过400ml，供全血间隔在3个月以上。

　　白细胞的分离，应在采血后48小时内进行。活细胞数应达到90%以上。

　　1.1.2诱生病毒

　　采用新城疫病毒（NDV）F株或仙台病毒，经检定血凝效价达到适宜滴度，方可投产。

　　1.1.3培养液

　　采用RPMI-1640，内含适量人血清和庆大霉素或卡那霉素。不得使用β椖邗０防嗫股亍Ｒ部捎闷渌室伺嘌骸?/P>

　　1.1.4制造工作室的设置，应符合工艺流程要求。冷库及各种生产用具，必须专用，严禁与其他异种蛋白质混用。制造工作室建筑应便于清洁、消毒、防霉。在制造过程中，应采取各种有效措施，防止细菌及热原质污染。直接接触制品的用具，用后应立即洗净，用前应除热原质及灭菌处理。

　　1.1.5生产用水应符合饮用水标准，直接用于制品的水应符合注射用水标准。所用各种化学药品应符合《中国生物制品主要原材料试行标准》规定，未纳入试行标准者应不低于分析纯。

　　1.2制造工艺

　　1.2.1诱生病毒

　　采用9～10日龄健康鸡胚，于尿囊腔接种适量病毒，37℃培养48～72小时，鸡胚发育良好，病毒达到适宜滴度后，收集尿囊液，并做无菌试验，合格后合并，抽样做滴度测定，放?/FONT>20℃待用。亦可用其他适宜方法制备诱生病毒。

　　1.2.2 白细胞悬液

　　用离心法分离血浆，吸取白细胞层，用氯化铵液裂解红细胞，或用其他适宜方法分离白细胞。然后用培养液稀释，以每ml含活细胞1.0×107为宜。

　　1.2.3 起动与诱生

　　白细胞悬液中加入少许白细胞干扰素，于37℃水浴搅拌培育2小时，加入适量诱生病毒，待干扰素效价达到最高峰时，收集上清，即为粗制干扰素，置?/FONT>20℃保存。

　　1.2.4 纯化

　　在粗制干扰素（效价应在1.0×10⁴IU以上）中加入硫氰酸钾盐析，然后分别在酸性和碱性条件下用乙醇分级沉淀，去除杂蛋白，再用硫氰酸钾提纯一次。亦可采用经卫生部批准的其他适宜方法。

　　1.2.5 溶解、透析或超滤

　　检查硫氰酸钾为阴性，除菌过滤后进行半成品检定。合格后方可分装、冻干。

　　1.2.6 半成品检定

　　半成品应做理化检查和比活性测定，比活性应≥1.0×106IU/mg蛋白。加入人血白蛋白作保护剂后，应做无菌试验、安全试验和热原质试验。试验方法及判定标准同成品检定。

　　1.2.7 冻干

　　按《人血白蛋白（低温乙醇法）制造及检定规程》1.2.5项规定进行冻干，但制品温度不得超过35℃。

　　2 成品检定

　　2.1 外观

　　本品应为白色或淡黄色疏松体，加水溶解后，为无色或淡黄色澄清液体，不得有摇不散的颗粒。

　　2.2 化学检定

　　按《生物制品化学检定规程》进行。

　　2.2.1 水分测定

　　水分含量应≤3%（g/g）。

　　2.2.2 pH值

　　pH值应为6.8～7.8。

　　2.2.3 硫氰酸钾残余量测定。

　　取2滴干扰素原液加2滴9%三氯化铁溶液，不呈现微红色为合格。

　　2.3 无菌试验

　　按《生物制品无菌试验规程》进行。每批抽样品不少于10支。

　　2.4 热原质试验

　　按《生物制品热原质试验规程》进行。每只家兔静脉注射0.2ml（2×105IU）。判定标准按该规程4.1项要求进行。

　　2.5 全试验

　　2.5.1 豚鼠试验

　　用体重300～400g豚鼠2只，每只腹侧皮下注射干扰素1ml（1.0×106IU），观察7天，动特健存，每只体重增加者为合格。如不符合上述要求，用4只豚鼠复试一次，判定标准同前。

　　2.5.2 小白鼠试验

　　用体重18～20g小白鼠5只，每只腹腔注射干扰素0.5ml（5×10⁵IU），半小时内动物不应有明显的异常反应，继续观察7天，动物均健存，每只体重增加者判为合格。如不符合上述要求，用10只小白鼠复试一次，判定标准同前。

　　2.6 HBsAg检测

　　每安瓿冻干制品（1ml装）加0.1ml灭菌注射用水溶解，用敏感性为1ng/ml以下的试剂盒测定，应为阴性。

　　2.7 效价测定

　　按附录方法测定，应为标示量的80%～150%。

　　2.8 残余牛血清蛋白含量测定

　　如采用组织培养法制备诱生病毒，则成品中残余牛血清蛋白含量应≤50ng/支。

　　3 规格

　　1.0×106IU/支

　　4 保存与效期

　　应保存于10℃以下。有效期自品效价检定合格之日起为1.5年。

　　附录干扰素效价测定

　　采用CPE（细胞致病效应）抑制为基础的抑制微量测定法，以每ml干扰素检品的最高稀释度仍能保护半数细胞（50）免受病毒攻击的稀释度的倒数定为干扰素单位。以国际单位（IU）表示，并用国家标准品校正结果。

　　1 细胞培养

　　将新鲜传代24～48小时的Wish细胞（人羊膜细胞）以约35万/ml的浓度另入96孔组织培养板上，每孔100μl，置37℃5%CO₂孵箱中培养4～6小时。

　　2 样品稀释与细胞混合

　　干扰素检品做4倍系列稀释，每份检品做6个稀释度（如100万单位，则测4^-12～4^-7）每个稀释度加2孔，与培养板中的细胞等量混合，置37℃5%CO₂5%CO₂孵箱培养18～24小时。

　　3 加病毒

　　倒掉培养板中的上清液，以100CCID₅₀/ml的浓度加入VSV（水泡性口腔炎病毒），每孔100μl，37℃5%CO₂孵箱培养24小时左右。

　　4 观察结果

　　显微镜下观察细胞病变，若病毒对照各孔细胞出现75%～1000%的明显病变和死亡（变圆、死亡、脱落（，而细胞对照组中的细胞仍生长良好（病变=0），则表明对照系统合格，结果成立。

　　5 计算

　　通常可按Reed?/FONT>Muench法计算，其步骤如下：

　　（1）计算保护百分比

稀释度病变平均值

（每孔）正常平均值

（每孔）累积数比例百分比

　　（%）病变正常正常/病变+正常 4^-1 0 4 0 13 13/13 100 4^-2 0 3 0 9 9/9 100 4^-3 1 2 1 5 5/6 83

4^-4

2/5

4^-5

－

4^-6

－

　　（2）求出干扰素单位

　　距离比=（·高于50%的百分数－50）/（高于50%的百分数－低分50%百分数）=（83－50）/（83－40）=33/43=0.77

　　即此批干扰素稀释到4-3。77（1∶186）时能保护半数细胞免受攻击病毒损害。此批干扰素效价为186单位，经国家标准品修正，得出干扰素的国际单位（以IU表示）。

冻干精制人白细胞干扰素使用说明书

　　本品系用特定诱生剂，诱导健康人白细胞，经提取后制成的冻干干扰素注射剂，为白色或淡黄色疏松体，加水溶解后为无色或淡黄色澄清液体。用于某些病毒性疾病和肿瘤的辅助治疗，对某些免疫缺陷性疾病也有一定疗效。

　　主要用于治疗慢性乙型肝炎、丙型肝炎、流行性出血热、尖锐湿疣、毛细胞白血病、小儿婴幼儿病毒性肺炎、子宫颈炎、疱疹性角膜炎、带状疱疹、流行性腮腺炎等疾病。如与化疗、放疗配合治疗肿瘤，可改善血象和全身症状。

　　用法　

　　本品用1～2ml灭菌注射用水溶解。可肌内注射或病变局部使用。肌内注射，每日1～2次，每次一支，连续5～10天为一疗程，每疗程间隔2～3天，或遵医嘱。

　　注意事项

　　1.对鸡蛋过敏者忌用。

　　2.注射本品后，一般无反应，个别患者注射后有低热反应或不同程度不适，停药后即可消失。

　　3.如安瓿有裂纹或溶解后有摇不散的颗粒，不可使用。

　　保存

　　应保存于10℃以下暗处。

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