冻干人凝血酶原复合物制造及检定规程

冻干人凝血酶原复合物制造及检定规程

　　本品系由乙型肝炎疫苗免疫健康人的血浆或血清，经低温乙醇法或卫生部批准的其他适宜方法提制而得的冻干制剂，并经病毒灭活处理。内含凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ，主要治疗Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ因子缺乏症及对肝病或各种原因所致的凝血酶原时间延长而拟作外科手术等。

　　1 制造

　　1.1制造要求

　　1.1.1血浆应无凝块，无纤维蛋白析出，非脂血，无溶血。新鲜分离的液体血浆或冰冻血浆、去除冷沉淀以及凝血固子Ⅷ以后的血浆均可用于生产。血浆蛋白分离的组分Ⅲ沉淀存放时间最长不得超过半年。所用之血浆来源应符合《原料血浆采集（单采血浆术）规程》。

　　1.1.2对制造工作室、设备及原材料的要求。

　　与《人血白蛋白（低温乙醇法）制造及检定规程》中1.1.3～1.1.4项要求相同。

　　1.2 制造工艺

　　1.2.1 可采用自血浆中直接凝胶吸附法或低温乙醇和聚乙二醇（PEG，MW4000或6000）分离蛋白并经DEAE葡萄糖凝胶A-50吸附法，亦可用经卫生部批准的其他适宜方法制备，并经卫生部批准的适宜方法进行病毒灭活处理。

　　1.2.2 稳定剂

　　制品内可加稳定剂，若加肝素，按总效价即血浆当量单位（PE）数加入等单位的肝素注射液。

　　1.2.3 除菌过滤及分装

　　本品宜采用薄膜过滤，直接分装入无菌的成品瓶内，每瓶装量根据效价及成品规格确定。

　　1.2.4 冻干

　　除菌过滤分装的制品经外观检查后立即旋冻，并按《人血白蛋白（低温乙醇法）制造及检定规程》1.2.5项的规定进行冻干，但制品温度不得超过35℃。

　　1.2.5 分批

　　同一制造工艺、同一容器混合的制品作为一批，不同滤品和不同机柜冻干的制品分为亚批。

　　1.3 半成品检定

　　每批半成品应进行效价测定及热原质试验，并按亚批做无菌试验。

　　1.4 成品规格

　　每瓶凝血酶原复合物的效价可有100、200、300、400、1000PE分钟。

　　2 成品检定

　　2.1抽样

　　每批成品应抽样作全面质量检定。不同机柜冻干制品应分别抽样作无菌试验及水分测定。

　　2.2 物理检查

　　2.2.1 外观

　　应为白色或灰绿色疏松体，无融化亦象，溶解后应为淡黄色或黄绿色澄明溶液，不应有异物或沉淀。

　　2.2.2 真空度

　　以高频火花真空测定器检测，瓶内应出现蓝紫色辉光。

　　2.2.3溶解时间

　　从冰箱取出制品，温度应先平衡至20～25℃，按瓶签标示量加入适量20～25℃灭菌注射用水，使每ml含10PE。制品应于15分钟内溶解。

　　2.3 化学检定

　　按《生物制品化学检定规程》进行。

　　2.3.1 水分

　　水分含量应≤3%（g/g）。

　　2.3.2pH值

　　取2.2.3项下溶液在20±2℃测定，pH值应为6.8～7.6。

　　2.3.3PEG含量测定

　　取2.2.3项下溶液测定，PEG含量应≤0.05%（g/ml）。

　　2.3.4 钠离子含量测定

　　钠离子含量≤160mmol/L。

　　2.4 凝血酶活性测定

　　取2.2.3项下的溶液按附录1进行测定。不得有凝块或纤维蛋白析出。

　　2.5效价测定

　　取2.2.3项下的溶液按附录2进行测定。每瓶效价应不低于标示量的80%。

　　2.6HBsAg检测

　　用敏感性为1ng/ml以下的试剂盒检测，应为阴性。

　　2.7抗HCV检测

　　用敏感的方法检测，应为阴性。

　　2.8 抗HIV-1及2检测

　　用敏感的方法检测，应为阴性。

　　2.9 无菌试验

　　按《生物制品无菌试验规程》进行。

　　2.10 安全试验

　　2.10.1豚鼠试验

　　用体重300～400g健康豚鼠2只，每只腹腔注射检品5ml（每ml含10PE），注射后半小时内动物不应有明显的异常反应，观察7天，动物均健存，每只体重增加者判为合格。如不符合上述要求，用4只豚鼠复试一次，判定标准同前。

　　2.10.2小白鼠试验

　　用体重18～20g小白鼠5只，每只腹腔注射检品0.5ml(每ml含10PE)，半小时内动物不应有明显的异常反应，继续观察7天，动物均健存，每只体重增加者判为合格。如不符合上述要求，用10只小白鼠复试一次，判定标准同前。

　　2.11 热原质试验

　　按《生物制品热原质试验规程》进行，注射剂量按家兔体重注射30PE/kg。判定标准按该规程4.2项要求进行。

　　2.12 鉴别试验

　　用免疫双扩散法，仅与抗人的血清产生沉淀线，与抗马、抗牛血清不产生沉淀线。

　　2.13根据病毒灭活方法，必要时应增加相应检定项目。

　　3 保存与效期

　　应严格保存于10℃以下避光干燥处。效期自效价检定合格之日起为2年。

　　附录1 凝血酶活性测定法

　　取人凝血酶原复合物溶液0.2ml，加0.5%（g/ml）纤维蛋白原溶液0.2ml，在37℃放置24小时，不得有任何凝块或纤维蛋白出现。测定时应同时做阴性及阳性对照。

　　阴性对照：0.2ml生理盐水加入0.5%(g/ml)纤维蛋白原溶液0.2ml，在37℃放置4小时，不得有任何凝块纤维蛋白出现。

　　阳性对照：取0.2ml0.5IU/ml凝血酶，加入0.5%(g/ml)纤维蛋白原溶液0.2ml，在37℃放置24小时，应有凝块或纤维蛋白出现。

　　注：含肝素的样品应根据肝素含量，用适量的硫酸鱼精蛋白中和样品内的肝素后再取样检查。

　　附录2 冻干人凝血酶原复合物效价测定法

　　1 试剂

　　1.1标准血浆

　　用3.8%枸橼酸三钠作抗凝剂，按1∶10比例采集全血（1份抗凝剂+9份全血）。4℃2000r/min离心20分钟，分离血浆。取30份新鲜正常人血浆等量混合后，分装于小塑料管内（0.5ml/支）。置-30℃冰箱保存备用。从采血到血浆冻结完毕不超过4小时。用时在37℃水浴中融化，然后置冰浴中备用，亦可制成冻干品。

　　1.2 基质血浆

　　用1.34%草酸钠人和抗凝剂，按1∶10比例采集健康人血（1份草酸钠+9份全血）10℃以下2000r/min离心20分钟，分离血浆，然后按10%（W/V）加入BaSO4，在37℃水浴内搅拦吸附15分钟，10℃以下2000r/min离心30分钟，取上清分装（3ml/支）。-30℃保存备用。从采血到血浆冻结不超过6小时。使用时在37℃水浴中融化，然后置冰浴中备用。

　　1.3 凝血活酶溶液

　　取干兔脑粉120mg，加2ml生理盐水，加0.1ml1.34%草酸钠溶液，放入45～50℃水浴中搅拌15分钟，2000r/min离心5分钟，取上清液置冰浴中备用。当日配制当日使用，或存放于-30℃1个月内使用。

　　1.40.025mol/LCaCl2溶液

　　称2.775g无水氯化钙（分子量110.98，AR），加水溶解至1000ml。

　　1.5 稀释液

　　生理盐水调pH7.4，再加白蛋白使最终浓度为0.2%。　

　　2 测定

　　2.1空白

　　取10×75mm试管2支，每管加0.1ml稀释液，0.1ml基质血浆，0.1ml凝血活酶，然后置37℃水浴中保温1分钟，再加0.1ml37℃预热的0.025mol /LCaCl2溶液，记录CaCl2加入至纤维蛋白形成的时间，应大于3分钟。

　　2.2标准曲线的准备

　　用稀释液将标准血浆作1∶2至1∶32的2倍系列稀释，然后取不同稀释度的标准血浆0.1ml代替空白稀释液，其他按空白测定过程和要求进行，两管测定结果相对误差应≤10%。

　　2.3 样品测定

　　用稀释液将样品作适当的2个稀释度（使凝固时间落于标准曲线内），然后取不同稀释度的样品0.1ml，代替空白稀释液，其他按空白测定过程和要求进行。

　　2.4结果计算

　　用回归方程计算：将不同稀释度的标准血浆凝固时间（秒）和稀释度的对数值输入到科计算器，得到一条标准曲线，r值应大于0.97。然后将稀释样品的凝固时间的对数分别输入到计算器内，得到相应的标准血浆的稀释倍数，用样品的稀释倍数除以相应的标准血浆的稀释倍数即为凝血酶原复合物的效价单位/ml（每一单位相当于1ml正常人血浆血液凝固因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的活性）。取样品两个稀释度的效价单位的均值为本样品效价单位/ml。

冻干人凝血酶原复合物使用说明书

　　本系由乙型肝炎疫苗免疫健康人的血浆，经低温乙醇法或经卫生部批准的其他适宜方法提制，再经病毒灭活处理的冻干制剂，为白色或灰绿色疏松体。每200血浆当量单位（PE）约相当于200ml新鲜人血浆中的Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ凝血固子含量，成品中尚含有200单位肝素及适量枸橼酸钠和氯化钠。

　　本品对凝血固子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ缺乏血症、抗凝剂过量、维生素K缺乏症、因肝病导致的凝血机制紊乱，以及凝血酶原时间延长而拟作外科手术等患者，均有显著的效果。

　　用法

　　本品专供静脉输注，应在临床医师的严格监督下使用。用前应先以20～25℃的灭菌注射用水或5%葡萄糖注射液按瓶签标示容量注入瓶内（制品刚从冰箱取出或在冬季温度较低时应特别注意使制品温度升高至20～25℃，然后进行溶解，否则易析出沉淀），轻轻摇动，使制品全部溶解（注意勿使产生很多泡沫），亦可用氯化钠注射液或5%葡萄糖注射液稀释成50～100ml，然后用带有滤网的输血器进行静脉滴注，滴注速度开始要缓慢，15分钟后稍加快滴注速度，一般每瓶200血浆当量单位在30～60分钟左右滴完。滴注时，医师要随时注意使用情况，若发现DIC的临床症状，要立即终止使用。并用肝素拮抗。

　　使用剂量随所缺乏的因子而异，一般每kg体重输10～20血浆当量单位（以后因子Ⅶ缺乏者，每隔6～8小时，因子Ⅸ缺乏者每隔24小时，因子Ⅱ和因子Ⅹ缺乏者每隔24～48小时，减少或酌情减少用量，一般历时2～3天）。在出血量较大或大手术时可根据病情适当增加剂量。在凝血酶原时间延长如拟作脾切除者要先于手术前用药，术中和术后根据病情决定。

　　注意事项

　　1.除肝病出血患者外，一般在用药前应确认患者是缺乏Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ因子，方能对症下药。

　　2.本品不得用于静脉外的注射途径。

　　保存

　　应严格保存于10℃以下避光干燥处。