冻干黄热活疫苗制造及检定规程

冻干黄热活疫苗制造及检定规程

　　本品系用减毒的黄热病毒17D株接种鸡胚，经研磨、离心，取上清液冻干制成。专供进入或经过黄热流行地区的人员预防黄热之用。

　　1 毒种

　　1.1 毒种来源

　　减毒黄热病毒17D株。

　　1.2 毒种检定

　　1.2.1 无菌试验

　　按《生物制品无菌试验规程》进行。

　　1.2.2 纯毒试验

　　用已知黄热病毒免疫血清做中和试验，证明其为黄热病毒。

　　1.2.3 猴体安全及效力试验

　　取冻干黄热17D毒种，加无菌生理盐水恢复其原液量，接种无黄热病毒中和抗体之恒河猴10只，每只脑内注射0.25ml（50000个小白鼠LD₅₀）。注射后第2、4、6日各采血1次，分离血清，分别做10倍系列稀释。以原血清及10^-1～10^-3各稀释度的血清分别脑内注射体重10～12g小白鼠6只，每只0.03ml，观察21天，检查病毒量，LD50均不得超过Log2（4天以内死亡的小白鼠不计算在内）。猴子经注射后2～4周，再采血1次，分离血清，做中和抗体测定。10只猴中至少要有9只血清表现阳性中和反应。在1个月的观察期中，发现脑炎症状或因而死亡者不得超过1只猴。

　　1.3 毒种保存

　　原毒种和生产毒种批均应冻干后真空封口，保存于-70℃以下。

　　1.4 毒种传代和生产毒种的制备

　　取毒种3支，启开安瓿后立即以稀释液（不应含有任何人体蛋白和外源血清或抗体）溶化。待全部溶化后接种于7日龄鸡胚卵黄囊，每胚0.2ml。分2组进行，每组不得少于10胚，置37.5～38℃培育。70～80小时按组收取活存鸡胚，每组不得少于4胚。去眼后分组混合研磨，加稀释液做成悬液，经2000r/min离心10分钟，吸取上清液，在鸡胚中传代，并抽样按《生物制品无菌试验规程》进行无菌试验。按同法连续传递2代，传代时可不等无菌试验结果，第3代毒种的鸡胚收获后，吸取容器内液体做无菌试验（方法同上），并将鸡胚冻存于-40℃以下。将无菌试验阴性之鸡胚取出融化。按每胚加入1ml稀释液研磨，经2000r/min离心10分钟，吸取上清液，加入稀释液稀释5倍后置冰浴中待用。同时做毒力滴定。此代即为生产毒种。

　　2 疫苗制造

　　2.1 接种鸡胚

　　用7日龄鸡胚，每胚接种适当稀释度毒种液0.1～0.2ml于卵黄囊，接种后滴蜡封口。

　　2.2 培育

　　接种后37.5～38℃培育，70～80小时开始收获。

　　2.3 收获

　　收获时剔去死胚，分组收获活存鸡胚，去眼，装入大管中，逐管吸取管内液体做无菌试验，在操作过程中盛鸡胚之大管应置冰浴中保冷，收获完毕置-40℃冻存。

　　2.4 研磨、离心

　　2.4.1 研磨

　　剔除洒菌鸡胚，将冰冻鸡胚大管置冷水中融化，倒入研磨桶内，按每胚1ml加入灭菌双蒸水，用电动研磨机8000r/min研磨3分钟。

　　2.4.2 离心，收取上清液

　　将研磨后的鸡胚悬液以减压虹吸法分装于500ml瓶中，塞以胶塞，用2000r/min离心30分钟。离心应在2～5℃进行。

　　收取上清液，每批装一个球瓶，换以胶塞，保存在冰浴中。

　　2.5 半成品检定

　　2.5.1 无菌试验

　　按《生物制品无菌试验规程》进行

　　2.5.2 冻干前病毒滴定

　　吸取球瓶中样品，作10倍系列稀释。取10-1～10-6之病毒液，每个稀释度用体重10～12g小白鼠6只，每只脑内注射0.03ml，接种部位忌用碘酒消毒，观察21天，计算LD50。

　　2.6 分装

　　疫苗保存在冰浴中进行分装，每安瓿分装量为0.5ml（10人份）。分装后将盛安瓿之金属盒放入-40～-50℃预冻2小时。

　　2.7 冻干

　　全部冻干过程为15～17小时，最后5小时升温20～25℃，最高不得超过25℃。冻干后安瓿真空封口。

　　3 成品检定

　　3.1 物理检查

　　外观为略带粉红色的疏松体，水分不应超过3%（g/g），加入稀释液应迅速溶解。

　　3.2无菌试验

　　按《生物制品无菌试验规程》进行。

　　3.3 猴体安全及效力试验

　　方法及要求见1.2.3项，如生产毒种做过猴体安全及效力试验则疫苗可免做。

　　3.4 豚鼠安全试验

　　按原分装量加入生理盐水溶解疫苗，用体重300～500g豚鼠2只，试验前2～3天每天量体温、称体重。然后每只腹腔注射0.5ml，观察7天，每天量体温，应无病症发生。如2只豚鼠均有显著反应（体温超过40℃，体重减轻）或死亡，则该批疫苗应废弃；如有1只豚鼠有症症发生，可再用3只豚鼠重试，重试中如有2只以上豚鼠发病时，判为不合格，制品应废弃；如有1只发病，则再重试，仍有发病则判为不合格，制品应废弃。

　　3.5 病毒滴定

　　同半成品检定。每只小白鼠脑内注射0.03ml。病毒滴度应≥3.66LogLD50。

　　3.6 稳定性试验

　　由每批疫苗成品取3安瓿，置37℃2周，滴度下降不应超过1Log。

　　3.7 鉴别试验

　　每亚批成品应按1.2.2项进行鉴别试验。

　　3.8 稀释液

　　氯化钠注射液，其质量应符合《中国药典》规定。

　　4 保存与效期

　　应保存于-20℃，自干燥之日起效期为1年半，如保存于2～8℃，效期为6个月。

冻干黄热活疫苗使用说明书

　　本品系用减毒的黄热病毒17D株接种鸡胚，经研磨、离心，取上清液冻干制成，为略带粉红色的疏松体。用于预防黄热。

　　接种对象

　　进入或经过黄热流行地区的人员。

　　用法

　　1.按标签标明的疫苗量，加10倍量的氯化钠注射液，混合均匀后方可进行接种。

　　2.于上臂外侧三角肌附着处，皮肤经酒精消毒后皮下注射0.5ml，一次。

　　禁忌

　　1.发热及急性疾病。

　　2.严重心、肝、肾等慢性病患者。

　　3.有过敏史，尤其对鸡蛋过敏者。

　　4.孕妇。

　　注意事项

　　1.启开安瓿和注射时切勿使消毒剂接触疫苗。

　　2.疫苗溶解不好，安瓿有裂纹，标签不清或过期失效者均不得使用。

　　3.安瓿启开后，疫苗应在1小时内用完。

　　保存

　　应保存于2～8℃避光处或-20℃。