血源乙型肝炎疫苗制造及检定规程

血源乙型肝炎疫苗制造及检定规程

　　本品系由无症状HBsAg携带者血浆提取的HBsAg，经纯化、灭活及加佐剂吸附后制成。用于预防乙型肝炎。

　　1 血源

　　1.1 对献血员的要求

　　1.1.1 献血员应为20～50岁无症状HBsAg携带者，其肝功能应无显著异常，并稳定。对献血员的其他要求按《原料血浆采集（单采血浆术）规程》执行。

　　1.1.2个月接种过活疫苗，1年内接种过狂犬病疫苗者，均不采血。

　　1.1.3 必要时以免疫扩散法（ID）测定HBsAg亚型。血源应以ad亚型为主，可有少量ay亚型。

　　1.2 单份血浆检查

　　1.2.1 无菌试验

　　按《生物制品无菌试验规程》进行。

　　1.2.2HbsAg测定

　　用对流电泳法测定，HBsAg滴度应≥1∶8，或用反向血凝法（RPHA）测定，滴度应≥1∶1024。

　　1.3 混合血浆检查

　　1.3.1支原体检查

　　按《生物制品无菌试验规程》进行。

　　1.3.2 取样接种孔雀绿培养基，35～37℃培养28天，结果应为阴性。

　　1.3.3 外源病毒检查

　　用Vero细胞和人二倍体细胞各3瓶，每瓶容量为10～15ml，各接种0.2ml样品，35～37℃培养10天，应无病变出现。用0.2%～0.5%鸡与豚鼠红细胞等量混合后于37℃吸附1小时，测定血吸附反应，应均为阴性。

　　2 抗原的浓缩和变化

　　2.1 血浆脱纤维

　　于血浆中加入氯化钙溶液，使之脱纤维。

　　2.2硫酸铵沉淀

　　于血清中加入硫酸铵饱和溶液，或用固体硫酸铵，使最后达到适宜的饱和度，沉淀HBsA.

　　2.3 超离心纯化

　　溴化钾等密度区带离心2～3次，每次离心后分部收样，根据紫外监测峰及密度测定，合并合格的样品，经超滤去盐浓缩。蔗糖速率区带离心1～2次，分离出HBsAg。

　　3 灭活

　　3.1 胃酶处理

　　将HBsAg悬液加入适量胃酶，置35～37℃处理4～5小时，最后超滤去胃酶。

　　3.2 尿素处理

　　于HBsAg悬液中加尿素至4～8mol/L置37℃处理4～5小时，超滤去尿素。亦可不用尿素处理。

　　3.3福尔马林灭活

　　于HBsAg悬液中按1∶4000加入福尔马林，置37℃72～96小时。不用尿素处理者可用1∶2000福尔马林灭活。

　　4 稀释与吸附

　　已灭活的疫苗原液经除菌过滤后，根据Lowry法检测折算的特异性蛋白含量进行稀释，加入A1（OH）₃吸附，并于疫苗内加入防腐剂。

　　5 半成品检定

　　5.1 总蛋白含量测定

　　用Lowry法测定，使用检定所提供的标准品。

　　5.2HBsAg含量测定

　　按总蛋白含量将样品稀释至不同稀释度，用RIA或火箭电泳法测定，使用检定所提供的标准品，HBsAg含量应在90%以上。

　　5.3 电镜检查

　　取每台离心机每次蔗糖离心后的样品，制作5个铜网，在60000倍电镜下，每个铜网观察6个视野，结果应主要为22nm球形颗粒，未见Dane颗粒为合格。有可疑Dane颗粒者应以加倍视野数检查。

　　5.4 残留杂蛋白检查

　　5.4.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳法

　　浓缩胶浓度为4%，分离胶为7.5%，加10μgHBsAg样品和适量的人血清白蛋白进行电泳，银染，试验样品应不出现明显杂蛋白带。

　　5.4.2SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法

　　HBsAg样品经SDS处理后在7.0%浓缩胶和15%分离胶中加入5μg进行电泳，结果在分离胶中应主要存在22000及28000分子量带，应不出现明显的杂蛋白带。

　　5.5HBV DNA检查

　　用HBv DNA片段制备探针，取200μg除菌后的样品与探针进行杂交，结果应为阴性。控针的灵敏度应≤1pg。

　　5.6 无菌试验

　　按《生物制品无菌试验规程》进行。

　　6 分装

　　每支安瓿分装1.0ml，HBsAg含量分别为10μg和30μg两种规程。

　　7 成品检定

　　7.1 无菌试验

　　按《生物制品无菌试验规程》进行。

　　7.2 安全试验

　　每亚批疫苗皮下注射体重14～16g小白鼠，每只0.5ml，注射后第3天和第7天各观察一次，允许皮下有硬结，但应健存。

　　7.3 化学检定

　　按《生物制品化学规定规程》进行。

　　7.3.1pH值测定

　　应为5.5～6.8。

　　7.3.2 游离甲醛测定

　　应含游离甲醛，但含量应≤0.01%。

　　7.3.3 氢氧化铝含量测定

　　每ml应不超过1.25mg。

　　7.3.4 氯化钠含量测定

　　应为0.8～0.95%。

　　7.3.5硫柳汞含量测定

　　不应超过0.01%。

　　7.4 效力和鉴别试验

　　将疫苗4倍递增稀释，每个稀释度接种BALB/cH2d或NIHq型雌性小白鼠20只，每只腹腔注射1.0ml，4～6周后采血，以RIA法测定抗-HBs，计算小白鼠ED50值与参比苗ED50值，结果以检品ED50值/参比ED50值，其比值≥1为合格。

　　7.5 抗-HBc检测

　　每批用6只体重为300～350g同性豚鼠，每只腹部皮下注射疫苗0.5ml，间隔一个月免疫第2次，之后一个月心脏采血，用RIA法检测免疫前后血清，结果抗-HBc应阴性，否则应重试。

　　7.6人体免疫观察及标准

　　每年度生产的头3批疫苗或前、中、后各一批疫苗进行人体免疫观察，观察对象为小学生或学龄前儿童，按0、1、2个月程序每批至少接种20人，每人于上臂三角肌肌内注射1.0ml，于3针接种后一个月采血，用RIA法测定三项指标，抗-HBs阳性率（S/N≥10）大于90%，6个月内未出现HBsAg者判为合格，否则需要重试。对免疫后单独出现高滴度抗-HBc者应分析原因。

　　8 保存与效期

　　保存于2～8℃暗处，不得冻结。自检定合格之日起效期为2年。

血源乙型肝炎疫苗使用说明书

　　本品系由无症状HBsAg携带者血浆提取的HBsAg，经纯化、灭活及加佐剂吸附后制成。

　　接种对象

　　乙型肝炎易感者（表面抗原阴性，转氨酶正常）。主要用于婴幼儿。

　　用法

　　1.上臂三角肌肌内注射。

　　2.免疫程序均按0、1、6个月各注射一针。新生儿接种时，0系指第一针免疫，免疫应于出生后24小时内完成，然后间隔1个月及6个月再各注射一针。

　　3.孕妇不进行乙肝感染指标检测时，所有新生儿均注射30μg、10μg、10μg/支疫苗3针。

　　4.孕妇进行乙肝感染指标检测时，乙肝表面抗原（特别是e抗原）阳性母亲的新生儿，注射30μg/支疫苗3针。与抗乙型肝炎免疫球蛋白（HBIG）联合使用，效果更佳。0时先注射HBIG一针，2～4周后开始注射疫苗。乙肝表面抗原阴性母亲的新生儿，注射30μg、10μg、10μg/支疫苗3针。

　　5.其他高成人群，如肾透析，以及其他职业性乙肝密切接触者，注射30μg/支疫苗3针。

　　6.一般易感者（包括婴幼儿、儿童及成人）注射10μg/支疫苗3针。

　　禁忌

　　患有肝炎、发热、急性或慢性严重疾病，或有过敏史者。

　　注意事项

　　1.本疫苗在注射前要充分摇匀。

　　2.如安瓿破裂，疫苗变质有摇不散的块状物不得使用。

　　装量

　　本疫苗分为10μg/支及30μg/支两种规格。

　　保存

　　保存于2～8℃暗处，严防冻结。