甘丙肽对幼鼠三叉神经主核突触传递的抑制

　　甘丙肽是Tatemoto于83年从猪小肠提取物中发现的一种29肽，其N和C端分别为甘氨酸和丙 氨酸残基。研究表明，甘丙肽广泛分布于中枢和外周组织，具有调节胃肠平滑肌收缩、抑制 胰岛素分泌、加强吗啡镇痛效应和参与记忆等功能，尤其在损伤组织的修复过程中发挥了重 要作用，因而受到越来越广泛的重视，在国际神经学界出现了研究热潮。损伤初级感觉神经 元末梢后，残存的感觉神经元内甘丙肽浓度显著增加。为了了解该浓度增加的生理作用及其 意义，我们运用细胞内记录和全细胞膜片钳的方法，以三叉神经主核(PrV)神经元为受试对 象进行了探索。

　　1　材料与方法

　　(1)脑片制备　选用6～16 d Wistar大鼠，乙醚麻醉后快速断头取脑，注意勿牵拉损伤三叉 神经干，并在离脑桥1 mm处切断该神经。用震动切片机横切脑干，获一与三叉神经干残端相 连的400 μm厚脑片。脑片室温下置于持续灌流以95%O2和5%CO2克氏液中孵育1 h备用。

　　(2)溶液　克氏液成分(mmol/L):NaCl 127,KCl 2.0,KH2PO4 1.2,CaCl2 2.4,MgCl2 1.3,NaHCO3 26,Clucose 10。微电极充灌液成分(mmol/L):葡萄糖酸钾 130，MgCl2 1,C aCl2 1,ATP 2,EGTA 10,HEPES 10。

　　(3)膜电位和膜电流记录　实验时脑片移至记录小室，持续克氏液灌流，流速约2 ml/min。 细胞内记录用Φ1.2 mm玻璃管，用卧式拉制仪拉成微电极，内充3 mol/L醋酸钾，直流电阻9 0～160 MΩ；膜片钳采用Φ1.5 mm玻璃管，电极分两步拉制，充灌内液后电阻为5～10MΩ 。 微电极由微操纵器推进插入PrV。细胞内记录用电磁震荡法插入细胞和电流钳记录；膜片钳 采用电极与细胞膜高阻抗封接后吸破细胞膜，进行电压钳记录。记录的信号经Axoclamp 2B 放大器输入Gould示波器和Could二道记录仪监视和描记。

　　静息电位稳定在-50 mV以上的细胞纳入统计。实验资料来自86只大鼠的136个细胞，数据用 均数±标准差(±s)表示。

　　2　结果

　　(1)电流钳记录的变化　含0.3 μmol/L甘丙肽的克氏液灌流脑片时，48个受试细胞中26个( 54.2%)产生膜电位超极化反应，幅度(2.8±1.3) mV。其时出现电刺激三叉神经干引发的 快兴奋性突触后电位(f-epsp)抑制和膜电阻降低，f-epsp高度降低23.6%±13.9%(P ＜0.01)，输入阻抗减少18.3%±9.7%(P＜0.05)。超极化幅度与甘丙肽剂量对数成近似 正比关系。

　　(2)　电压钳记录的变化　将细胞膜电位钳制在静息电位水平时，灌流含0.3 μmol/L甘丙 肽的克氏液，88个受试细胞中有51个(57.9%)出现外向性电流(11.6±9.1)pA。低钙高镁 不能阻抑该电流，抑制率仅4.2%±1.7%(P＞0.01)。而四乙基铵(TEA)可阻抑之，抑制 率69.8%±12.7%(P＜0.01)。改变钳制电位水平，外向性电流随 膜电位绝对值增大而减少，当低于钾平衡电位时该电流逆转为内向性电流，其翻转电位为(- 87±5.3)mV(n=5)。

　　3　讨论

　　资料表明，无论对肠肌收缩、胰腺分泌，还是对感觉传入冲动，甘丙肽都作为神经调节物主 要发挥抑制作用。本实验在PrV上研究显示，甘丙肽既抑制f-epsp传递，又使细胞出现超极 化及外向性电流反应，也发挥了抑制性作用。该外向性电流不能被低钙高镁所阻抑，提示可 能是甘丙肽的直接作用。甘丙肽使PrV细胞产生超极化时伴膜电阻降低；外向性电流幅度随 膜电位超极化而减小，在接近钾平衡电位时消失，进一步超极化时出现反转；该电流可被钾 通道阻断剂TEA所阻抑，均提示甘丙肽引致的超极化和外向性电流是由细胞内钾外流所引致 。现知中枢内存在甘丙肽Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三种亚型受体，甘丙肽通过PrV细胞哪些亚型受体发挥 抑制作用，尚有待进一步鉴别。

　　损伤初生大鼠三叉神经末梢后，三叉神经节细胞内甘丙肽浓度在出生后2～12 d内显著增加 。甘丙肽抑制初级感觉传入神经元与第二级传入神经元之间兴奋传递，这使甘丙肽及其激动 剂有可能发挥镇痛剂的作用；同时抑制了感受器-传入神经-神经中枢-传出神经-效应器 反射弧，使受损部位活动减少，避免了该组织进一步加重损伤；此外，甘丙肽还可抑制由于 外周神经损伤引致的中枢神经结构的改建和重组，有利于受损组织的修复与重建。综上可知 ，甘丙肽的抑制作用是重要的机体保护机制之一。