Fas分子与肝细胞凋亡

　　Subject headings　hepatocytes；apoptosis；liver dieases/pathology；Fas/FasL；CD95/CD95L；signal transduction

　　近年来细胞分子生物学领域中的两个重要进展，即细胞凋亡概念的提出和Fas分子的分离与鉴定对肝病的研究有重要影响，加深了人们对肝细胞损伤与死亡的认识. 1993年Ogasawara et al［1］进行的Fas单抗毒性实验证实了Fas分子系统在肝细胞凋亡或损伤中发挥着极其重要的作用，揭开了Fas分子对肝细胞功能调节研究的序幕. 研究证实，Fas分子系统既与肝细胞损伤有关也与肝细胞的整体功能调节有关［2，3］.

　　1　Fas分子

　　人Fas分子定位于10号染色体q23，cDNA长度为2534bp，编码325个氨基酸残基36KD的Ⅰ型跨膜糖蛋白，分子结构包括3个部分，膜外的N末端区，跨膜区和膜内的C末端区. 膜外区为155个氨基酸组成的信号肽区，其氨基酸序列相对保守且具有膜受体特征，当与其配体FasL结合后启动凋亡信号的跨膜传递，跨膜区位于分子结构的中段，由15个氨基酸残基构成，构成胞质区的145个氨基酸残基中的80个在传递凋亡信号中发挥着关键性的作用，故将该区称为“死亡区域”(death dormain)，而Fas分子又被称为“死亡受体”［4］.

　　人Fas分子主要分布于活化的T，B淋巴细胞上，造血细胞及多种肿瘤细胞上也有表达，尽管正常人肝细胞并不表达Fas分子，但在病变的肝细胞上却有广泛的表达，且其表达强度与肝细胞的损伤程度及肝病的预后有密切的关系［5，6］. 目前已证实，肝脏病变时，肝实质细胞枯否细胞，肝窦内皮细胞和肝内浸润的淋巴细胞均可表达Fas分子或其配体，但因其在表达的部位不同，其生物学意义也各不相同［7］.

　　2　Fas分子介导的肝细胞凋亡的信号传递机制

　　Fas分子与其配体，单抗或其自身结合均可形成二聚体而启动凋亡信号的传递，但Fas分子介导的凋亡信号的传递无需细胞核的参与，不伴有基因的活化，并可以导致无核细胞凋亡发生，这与其他凋亡信号的传递有明显的不同.

　　尽管Fas分子介导的细胞凋亡的信号传递的详细分子生物学机制还未完全明确，目前认为其主要过程包括以下步骤［8-12］. ①死亡受体分子的活化：由于Fas分子中的死亡结构域有相互聚集的倾向，死亡配体与其相应的死亡受体(Fas-FasL)结合后诱导Fas分子中的死亡结构域与转接器蛋白(adaptor portein)分子中的死亡结构域结合，转接器蛋白又称Fas分子相关蛋白(Fas-associated death dormain, FADD). ②凋亡酶体(apoptosome)的形成：FADD分子的另一端含有可与胱冬酶原-8(pro-csapase-8)相结合的死亡效应器结构域(death effector dormain, DED),诱导两者的结合. 这样由Fas-FasL-FADD-Pro-caspase 8串联构成的复合物称为“凋亡酶体”. ③胱冬酶(caspase-8)家族的活化：胱冬酶被认为是凋亡效应器酶，凋亡酶体中由于胱冬酶原的聚集而导致自身的水解与活化形成有活性的胱冬酶-8(caspase-8)，并可以依次激活其同源酶家族中的其他酶原形成自身激活瀑布(如caspase-8...caspase 6,7...caspase 3)，而胱冬酶-3可以激活DNA降解酶，降解DNA为特异性片段导致细胞凋亡的发生.

　　3　Fas分子在肝内表达的生物学意义

　　肝内多种细胞可以被诱导而表达Fas分子，但其表达的细胞不同，强度不同而具有不同的生物学意义.

　　3.1　在肝实质细胞上的表达　Weintraub et al［13］在Fas和FasL基因双缺陷小鼠(B6/lprgld)模型上发现，尽管小鼠能正常的发育与生长，但在无任何炎症刺激时肝内即有大量的炎性细胞浸润，而向肝实质细胞内导入微量的Fas并给以弱刺激即可以诱导广泛的肝实质细胞凋亡，提示Fas分子在肝实质细胞的表达对肝细胞的功能调节具有极其重要的意义. 最近的研究还证实Fas分子介导的肝细胞凋亡是各型肝病的肝细胞损伤与死亡的主要机制之一，Fas分子在肝实质细胞上的表达强度与HBV和HCV在体内的复制程度有关，并与肝实质细胞的损伤程度相一致. 显然，病毒性肝炎时Fas分子在肝实质细胞上的表达的生物学意义在于清除病毒感染细胞而避免诱发过度的炎症反应而使非感染细胞受累. 业已证明Fas分子介导的肝细胞凋亡，即肝实质细胞的损伤是原位肝移植后排斥反应时肝实质细胞的损伤的主要机制［14］.

　　3.2　在肝星型细胞上的表达　在肝组织损伤过程中，肝星型细胞(hepatic stellate cell, HSC)从静止型向激活型转变，并成为肝组织损伤修复过程中细胞外基质的主要来源. Saile et al［5］对体外体内的FSC激活后的转归研究发现，静止的FSC无凋亡现象，但随着时间的延长，凋亡现象逐渐增加，过度型8%+5%，激活型18%+8%，同时伴有Fas/FasL表达的增加. FSC的凋亡可以被Fas阻断型抗体完全阻断，而给以Fas激活型抗体则95%的FSC呈现凋亡现象. 据此，Eischen et al［15］认为，肝组织损伤修复后激活的FSC转归可能有以下两个方面：①通过Fas/FasL途径凋亡，②转回静止状态. 前者可能是清除激活过量FSC的一个主要方式.

　　3.3　在枯否细胞和肝窦内皮细胞上的表达　Muschen et al［7］在内毒素刺激的小鼠原代培养枯否细胞，肝窦内皮细胞和肝实质细胞上发现，内毒素刺激后，枯否细胞和肝窦内皮细胞上FasL分子表达增加，并可见可溶性Fas的分泌，而肝实质细胞上仅见Fas分子表达的增加，未见Fas分子表达的改变，这提示枯否细胞和肝窦内皮细胞是Fas分子介导肝实质细胞凋亡的主要调节者，即枯否细胞和肝窦内皮细胞表达FasL的强度部分决定肝实质细胞凋亡及损伤的程度. 其生物学意义可能还包括清除肝内激活的过多的淋巴细胞，促进其凋亡，避免对肝细胞的过度损伤. 而血清可溶性Fas分子升高的意义可能在于阻断FasL的生物学作用，避免过度的肝细胞凋亡的发生.

　　3.4　在肝内浸润淋巴细胞上的表达　FasL主要表达在激活的NK及T淋巴细胞上，以旁分泌机制介导周围细胞的细胞毒活性，或以自分泌机制启动激活诱导的细胞凋亡(activation-induced cell death, AICD)而“自杀”. RT-PCR检测小鼠新鲜分离的肝内NK细胞显示，肝内未受抗原刺激的NK细胞具有结构性表达FasL的功能，能杀死转染Fas的淋巴细胞，而对Fas表达阴性的间质细胞无作用，在给以可溶性Fas分子的Fc片段可以阻断这种杀伤［15］. 人静息的NK细胞并不表达FasL,但被刺激和诱导(如IL-2诱导)后可以表达，并特异性地杀伤表达Fas的细胞，血清IL-2浓度的升高是细胞免疫激活的标志，这提示炎症时肝内NK细胞的激活可以杀伤表达Fas的肝实质细胞，参与肝细胞损伤的调节.

　　4　肝细胞Fas分子表达的干预与调节

　　由于Fas分子系统在肝细胞上表达的广泛性与复杂性，参与肝细胞凋亡的调控，在肝细胞功能稳态的调节中具有重要意义，因此，调节肝细胞Fas分子的表达及其信号传递就具有及其重要的意义.

　　4.1　诱导Fas分子的表达，促进肝细胞的凋亡　细胞凋亡是宿主清除病毒感染细胞的有效抗病毒机制，可以被CTL所触发，也可以被炎性细胞因子或病毒裂解细胞的产物所诱导. 某些病毒如Bcl-2同源病毒E1B19K编码的病毒蛋白可以抑制Fas分子凋亡信号传递的效应酶——胱冬酶的激活而抑制病毒感染细胞的凋亡，使病毒感染细胞不能被清除而导致病毒感染的慢性化. Bertin et al［16］发现，马疱疹病毒Ⅱ型(EHV-2)和软疣病毒MC-159编码的E-8蛋白和MC-159蛋白是含有死亡效应序列的抗凋亡蛋白，可与FADD结合而抑制Fas介导的凋亡信号的传递，导致感染病毒细胞的凋亡抑制，造成病毒感染的持续与慢性化. HBV和HCV感染的慢性化是否与病毒诱导的抗凋亡蛋白的产生有关目前尚无报道，但诱导病毒感染细胞的Fas分子的表达显然有助于病毒感染细胞的清除与肝纤维化的逆转.

　　不可修复的细胞凋亡与肿瘤的发生与发展有关. Kubo et al［17］对35例肝癌标本进行DNA末端标记及Fas/FasL免疫组化的检测发现，肝癌组织肝细胞凋亡明显较周围正常肝组织为少，Fas/FasL在癌组织的表达也明显低于癌周组织(P＜0.0001)，这提示促进肝癌细胞Fas/FasL表达有助于肝癌的治疗. 业已证明Fas分子在细胞上的表达可以被细胞因子所调节. Zhou et al［18］发现，人周围血T细胞对Fas介导的凋亡信号不敏感，但给以IL-2 10kU/L处理后，T细胞即恢复对Fas敏感的表型，提示IL-2可以上调Fas分子的表达，促进Fas介导的凋亡信号的传递.

　　4.2　抑制Fas分子的表达，阻断凋亡信号的传递　肝移植失败的主要机制是由CTL介导的免疫排斥，目前认为Fas分子介导的细胞凋亡是肝移植排斥反应中CTL主要的细胞毒机制［19］. 因此，抑制肝移植后肝实质细胞Fas分子的表达对抗排斥反应具有极其重要的意义. 已证实cyclosporin A可以阻断Ca2+依赖性磷酸化酶，而抑制Fas分子的表达，酪氨酸激酶抑制剂(herbimycin A)可以抑制Fas分子介导的凋亡信号的传递的启动［5］.

　　胱冬酶是Fas/FasL诱导肝细胞凋亡的主要效应酶，Jones et al［12］发现该酶抑制剂Ac-DEVD-CHO在极低浓度下(1μm/L-10μm/L)对肝细胞凋亡即具有强有力的抑制作用，提示胱冬酶特异性蛋白酶抑制剂可能是将来新的一类“保肝药”，而被用于各型肝细胞损伤的治疗。

　　总之Fas分子系统作为目前肝病领域里新的研究热点，进展十分迅速，但以下问题仍未解决：①慢性HBV和HCV感染时，Fas分子表达增强，但凋亡信号的传递却明显受抑，其分子机制是什么. ②慢性肝病时肝纤维化发生过程中HSC的抗凋亡机制是什么. ③调节Fas分子信号传递的更有效药物. ④安全、稳定、高效的Fas/FasL质粒载体的构建. 以上问题的解决显然将成为肝病研究和治疗上新的里程碑.

　　综上所述，抑制肝细胞Fas表达将有助于减轻肝细胞损伤的程度，提高肝移植的成活率，而促进肝细胞Fas分子的表达将为肝癌和肝纤维化的治疗开辟新的途径.

　　通讯作者　魏红山

　　5　参考文献

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　　7 Muschen M, Warskulat U, Douillard P, Gilbert E, Haussinger D. Regulation of CD95 (APO-1/Fas)　receptor and ligand expression by lipopolysaccharide and dexamethasone in parenchymal and nonparenchymal rat liver cells. Hepatol. 1998;27:200

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　　15 Eischen CM, Leibson PJ. Role of NK cell associted Fas ligand in cell-mediated cytotoxicity and apoptosis. Res Immunol. 1997;148:164

　　16 Bertin J, Armstrong RC, Ottilie S, Martin DA, Wang Y, Banks, S, Wang GH. Senkevich TG. Alnemri ES, Moss B, Lenardo MJ, Tomaselli KJ, Cohen JI. Death effector domain-containing herpesvirus and poxvirus proteins inhibit both Fas and TNFR1-induced apoptosis. Proc Natl Acad Sci USA. 1997;94:1172

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