附录三全血细胞培养染色技术常用试剂配制

附录三　全血细胞培养染色体技术常用试剂配制

　　一、国内实验室应用试剂配制

　　（一）培养液

　　（1）RPMI1640培养液：称取RPMI培养基9.8g，碳酸氢钠1.9g、青霉素100u/ml，加双蒸水至1000ml，调节　pH7.2～7.4无菌过滤冻存备用。

　　（2）小牛血清商品：成都生物制品厂。

　　（3）植物凝集素（PHA）：自制或成品（重庆药检所）。

　　（4）pH调整液：5%NaHCO₃溶液高压灭菌（8磅15min），0.1N稀盐酸液100ml。

　　（5）秋水仙素：10mg/ml无菌过滤高压灭菌（8磅10min）。

　　（6）磷酸缓冲液：pH7.4。

　　磷酸氢二钠28.8g(H₂O)、磷酸二氢钾2.67g(无水)，溶于1000ml双蒸水中，加肝素，终浓度为100u/ml。

　　（7）Giemsa染色液：

　　Giemsa粉剂　　　　　　　　　　　1g

　　甘油　　　　　　　　　　　　　　66ml

　　在研钵中，加入少量甘油油仔细研磨然后放甘油全部加磨，60℃温箱中保温2h，冷却后加入甲醇66ml。装入有色瓶中混合待用。染色时用pH7.4磷酸缓冲液稀释10倍，随配随用。

　　（二）固定液

　　（1）甲酸：冰乙酸3：1混合即用。

　　（2）PBS缓冲液配制：

　　NaCl　　 16g　　 Na₂HPO₄(12H₂O)　　5.65g

　　KCl　　　0.4g 　KH₂PO₄0.4g

　　加双蒸水至1000ml pH7.0。

　　取5%胰酶（生理盐水配制）1ml加入50ml PBS液中（最终浓度为0.025%），4℃冰箱待用。

　　二、细胞培养（Bhatl B和McGee JOD,1990）

　　1．完全培养基

　　RPMI　　　　　　　　　　　　 76.0ml

　　胎牛血清 　　　　　　　　　　20.0ml

　　植物凝集素　　　　　　　　　　2.0ml

　　抗生素/抗菌素溶液（100×）　　1.0ml

　　L-谷氨酰胺（100×）　　　　　1.0ml

　　2.BudR(5’-Bromo-2-deoxyuridine, 5’-溴-2-脱氧尿嘧啶)溶解10mg/ml BudR于dH₂O中，0.2μm滤膜过滤除菌，分装后-20℃储存，BudR要在柔光（弱光）下操作。

　　3．胸腺嘧啶（Thymidine,Thd）　　按250μg/ml溶解于dH₂O中，过滤后分装储存于-20℃。

　　4．Colcemid(Sigma)　　5.0μg/ml溶于dH₂O中，过滤后分装储存于-20℃。

　　5．KCl（0.75mol/L）　　溶解560mg于100ml dH₂O中，新鲜配制37℃保存。

　　6．固定剂　　甲醇冰醋酸按3：1（V/V）混合即可，现用现配，置冰上待用。

　　7．缺口平移试剂盒（Amersham和BRL公司）

　　8．生物素7-dATP(BRL)

　　9.糖原（BRL）

　　10．RNA酶A（Sigma）

　　（1）储备液

　　称取RNA酶A 1g溶于100ml醋酸钠中，置沸水中煮10min，分装后储于-20℃。

　　（2）工作液

　　用储备液按1：100稀释。

　　11．20×SSC

　　NaCl　　　　　　　　　　　 175g

　　柠檬酸三钠 　　　　　　　　88g

　　dH₂O 　　　　　　　　　　1000ml

　　固定试剂溶解后，dH₂O定容至1000ml，调pH至7.4，高压灭菌。

　　12．杂交液（高深度，HMmix）

　　去离子甲酰胺　　　　　　　　　 6.0ml

　　100×Denhardt’s液　　　　　　1.0ml

　　50%硫酸葡聚糖　　　　　　　　 2.0ml

　　1%人或鲑精DNA^※

　　20×SSC

　　※：临用前加入，终浓度为100～200μg/ml。

　　该液为高浓度杂交液， 存于4℃。

　　13．PBT液

　　BSA　　　　　　　　　 　　5%

　　Triston X-100/(PBS)　　 0.1%

　　注：BSA液用前应用Whatman 3mm滤纸过滤。

　　14．兔抗生物素（α-生物素）单克隆抗体

　　用PBT液1：100稀释。

　　该单抗现可从英国Dako公司购得。

　　15．金（10～20nm）标羊抗兔二抗

　　用PBT液1：50稀释。

　　16．银溶液（Janesen）

　　17.Hoedst 33258（Sigma）

　　储备液（100×）

　　Hoedst染料　　　　　　　　　　 5mg

　　甲醇　　　　　　　　　　　　　 10ml

　　工作液：用2×SSC 1：100稀释储备液。

（吴康 蔡文琴）