第六节样品处理与注意事项

第六节　样品处理与注意事项

　　一、样品处理

　　DNA是染色体的主要组成部分，是PCR的扩增模板。要进行PCR，研究DNA结构与功能或者用于诊断目的，首先必须从生物体内提取DNA。DNA往往以核蛋白形式存在，其分子量大（人的染色体DNA平均大小为3.0×10⁹bp），提取DNA应尽量保持DNA完整性和纯度，即在提取中尽量避免机械张力引起的DNA分子降解，又要注意杂质及蛋白的去除，防止胞内酶解DNA。因此，提取DNA的基本过程是：用Proteinase K及SDS，在EDTA存在下，裂解细胞，消化蛋白质，使核蛋白解聚及胞内DNA酶失活，然后用酚/氯仿多次提取去除蛋白质，在DNA中若混有少量RNA，可用RNase去除，最后用乙醇沉淀得到DNA。

　　理论上PCR对模板DNA纯度及完整性要求并不高，细胞经过热变性使DNA释出就可以作为模板，依赖引物的选择性进行扩增。对拷贝数很多的基因组，确实如此。但当待扩增的拷贝数甚少而无关细胞甚多时则扩增就不易成功，其原因是：①非希望的扩增增多，掩盖了所需扩增的片段，使其数量减少至不能检测到的程度。②生物样品中的杂质会抑制PCR反应，最主要的是血液和琼脂糖。例如在100μl反应液中加入1μl全血就可引起抑制，0.8μmol/L的血红素也会引起明显的抑制。对于含血液的样品，可以用渗透压溶解红细胞，离心集取细胞核，洗除血红蛋白，再用蛋白酶/表面活性剂处理的方法来解决。另一简单的方法是煮沸之，使释放DNA，并沉淀Hb，用上清液作PCR。

　　现将PCR前处理各种标本的基本方法介绍如下：

　　1．所需溶液

　　（1）PBs 0.85% W/V NaCl,66mmol/L Na₃PO₄ pH7.0

　　（2）含表面活性剂及蛋白酶K的PCR缓冲液

　　50mmol/L KCl, 10mmol/L Tris-HCl(pH8.3) 2.5mmol/L MgCl₂

　　0.1mg/ml明胶，0.45%NP40,0.45%吐温20

　　高压灭菌，冷冻储存。临用前加0.6μl的10mg/ml蛋白酶K（水溶液）至100μl溶液中。

　　（3）溶血缓冲液

　　0.32mol/L蔗糖，10mmol/L Tris-HCl pH7.5

　　5mmol/L MgCl₂,1% Triton X-100

　　2．提取方法

　　（1）用聚蔗糖-泛影葡胺梯度法从血液或培养细胞分离的单核细胞（当PBC〈10%细胞数时用此程序）

　　①将细胞样品用PBS稀释至10ml，置15ml锥形离心管中；

　　②100×g离心2～5min，吸去上清；

　　③细胞再悬浮于10ml PBS中重新离心洗涤；　

　　④沉淀物悬浮于溶液2中，使细胞浓度约为6×10⁶/ml，移至1.5ml管中；

　　⑤50～60℃保温1h；

　　⑥95℃保温10min使蛋白酶变性；

　　⑦冷冻储存。

　　如果RBC多于细胞的10%，则用PBS洗1次（步骤1，2）后，悬浮于1ml溶液3，并转移至1.5ml离心管中，如程序B-2离心1次，再悬浮于溶液2中按程序A-4继续进行。

　　（2）全血：此法使胞膜溶解故胞浆DNA丢失，约可得20μg DNA/0.5ml血。

　　①0.5ml全血与0.5ml溶液3共置1.5ml管中；

　　②13000×g离心20s；

　　③吸去上清，加1ml溶液3，旋涡混合使沉淀重新悬浮；

　　④重复第2，3步2次；

　　⑤13000×g离心2s，吸去上清，悬浮于0.5ml溶液2中；

　　⑥按程序A5～7步进行。

　　（3）拭子

　　①用PBS预温的试子从宫颈、阴道或阴茎采样；

　　②拭子置入2ml PBS（含抗霉剂）于15ml离心管中，室温可保存24h，置4℃可保存更长时间。也可用旋涡混合器振荡使细胞加速游离；

　　③取去拭子，2000～13000×g离心5min，吸去上清；

　　④如含RBC则加1ml溶液3，转移至1.5ml E管中，按程序B-2开始进行；

　　⑤如不含RBC则加溶液2，按程序A-4进行。

　　（4）头发

　　①拔下头发，剪下头发近端0.5cm段；

　　②置入0.4ml溶液2中（1.5ml管）；

　　③按程序A5～7步进行，用50μl体系作PCR。

　　（5）血细胞RNA用焦碳酸二乙酯（DEP）抑制RNase,NP-40溶胞但不溶核。

　　①用聚蔗糖-泛影葡胺或其它方法分离单核细胞；

　　②置2ml离心管中，加PBS至细胞中，500×g离心5min；

　　③配制（DEP）溶液用无水乙醇将DEP作9+1稀释，再用NP-400.5%作1：999稀释（抑制RNase）；

　　④细胞沉淀中加200～400μl此溶液，旋涡混合；

　　⑤13000×g离心10s；

　　⑥上清转移至新管中，37℃保温20min，90℃，10min；

　　⑦离心，上清转移至新管。取5～10μl作反转录；

　　⑧如果反转录失败，可能因DEP残留，可将样品再在90℃加热5min，再做试验；

　　⑨本法也可用于培养细胞。

　　二、注意事项

　　PCR只需几个DNA分子作模板就可大量扩增，应注意防止反应体系被痕量DNA模板污染和交叉污染，这是造成假阳性最大的可能。下例可形象说明污染的严重性。

　　典型的PCR反应可在100μl反应液中扩增10¹²个DNA，此液倾入50nm×25m×2m的游泳池中，充分混合取0.1ml池水,其中含有40个分子的DNA,用PCR扩增即已可呈阳性，这一点对检测HIV更为重要。常规只要15个拷贝的核酸即可查出。假阳性结果往往来自痕量污染和交叉污染，尤其在待扩增靶序列浓度低的情况下，更有必要采取防备措施。

　　（1）DNA处理最好用硅烷化塑料管以防粘附在管壁上，所有缓冲液吸头、离心管等用前必须高压处理，常规消耗用品用后作一次性处理，避免反复使用造成污染。

　　(2）PCR在超净台内进行，操作前后紫外灯消毒。

　　超净台内设内供PCR用微量离心机、一次性手套、整套移液器和其它必须品；移液品用一次性吸头和活塞的正向排液器，防止移液器基部污染。

　　（3）PCR操作应戴手套并勤于更换。

　　（4）成套试剂，小量分装，专一保存，防止它用。配制试剂用新器具，用后作一次性处理。

　　（5）试剂管用前先瞬时离心（10s），使液体沉于管底，减少污染手套与加样器机会。

　　（6）最后加模板DNA（包括在石蜡油后），马上盖好，混匀，瞬时离心（10s），使水相与有机相分开。加入模板且忌喷雾污染，所有非即用管都应盖严。加模板DNA后应更换手套。

　　（7）实验设阳性、阴性对照。