第三节载脂蛋白B基因多态性的检测

第三节　载脂蛋白B基因多态性的检测

　　ApoB是富含胆固醇和甘油三酯脂蛋白的重要组成成分，对脂质在人体转运、代谢、维持体内脂质水平的恒定起重要作用。大量临床资料及流行病学调查表明：血清ApoB及低密度脂蛋白（LDL）水平与动脉粥样硬化呈正相关，是其主要危险因素之一。近十年来，从分子水平研究ApoB，阐明动脉粥样硬化及高脂血症的发病机理，寻找其遗传标志受到广泛重视，现已发现：ApoB基因具有明显的多态性，其核苷酸变异有75处，其中导致氨基酸变异的有54处，例如多种酶限制性片段长度多态性（RFLP_s），3’端高变区的数目可变的串联重复顺序（VNTR），信号肽（SP）多态性。大量研究表明，ApoB的基因多态性与动脉粥样硬化有不同程度的关系。

　　一、分析ApoB基因多态性的方法

　　对ApoB基因多态性进行检测、分析的方法很多，如：限制性内切酶的酶谱分析法，PCR直接分析法，PCR产物RFLP分析法，等位基因特异性寡核苷酸（ASO）杂交法等等，其中最多用且简单的方法有PCR产物直接分析法和PCR产物RFLP分析法。

　　PCR产物直接分析法，是采用合适的引物，通过多次扩增，获得靶基因序列扩增片段，直接分析法片段的大小，可用于分析基因的缺失与插入。种方法简便、快速、灵敏，可分析ApoB基因VNTR、SP多态性。

　　基因突变往往会造成限制性内切酶识别位点的改变，如位点丢失或产生新位点，通过PCR扩增某一特定片段，再用限制性内切酶酶切扩增产物，电泳观察片段的大小，这种方法用于检测酶切位点改变的基因突变，可直接判断基因型，是研究ApoB基因PFLP_s的较好方法，具有灵敏、简便、可同时对大量样品进行分析等优点。

　　二、ApoB基因多态性的检测

　　ApoB基因多态性研究较多的有RFLP、VNTR、SP多态性，分别叙述如下：

　　1．RFLP的检测

　　ApoB有10种RFLP，一般采用PCR-RPLPs方法进行分析，研究较多的有第26外显子XbaⅠ、MspⅠ位点，第29外显子EcoRⅠ位点，在Apob DNA上的位置如图19-6，图19-7所示：

图19-6 ApoB基因部分RFLP_S示意图

图19-6 ApoB基因多态性位置示意图

　　用于PCR的引物如下：

　　XbaⅠ-5’GGAGACTATTCAGAAGCTAA

　　XbaⅠ-3’GAAGAGCCTGAAGACTGACT

　　EcoRⅠ-5’CTGAGAGAAGTGTCTTCGAAG

　　EcoRⅠ-3’CTCGAAAGGAAGTGTAATCAC

　　MspⅠ-5’TCTCGGGAATATTCAGGAACTATTG

　　MspⅠ-3’CTAAGGATCCTACAATGTCAAGGT

　　XbaⅠ酶切位点的RFLP是由于2488位密码子第三个碱基突变（ACC→ACT），产生一个XbaⅠ酶切位点，但并未改变所编码的氨基酸序列，存在XbaⅠ酶切位点（X⁺）的等位基因，其PCR产物酶切后出现433bp和277bp两个片段，不存在XbaⅠ酶切位点（X^-）的等位基因，PCR产物经酶切后仍为其产物710bp片段。

　　RFLP是由于4154位密码子改变（GAA→AAA），使原有的EcoRⅠ酶切位点消失，氨基酸序列中赖氨酸取代谷氨酸，存在EcoRⅠ酶切位点（R⁺）的等位基因，其PCR产物经EcoRⅠ酶切后得到253bp及227bp两个片段，不存在EcoRⅠ酶切位点（R^-）的等位基因，其PCR产物酶切后仍为480bp的片段。

　　MspⅠ酶切位点的RFLP，是由于3611位密码子改变（CGG→CAG），谷氨酰胺取代了精氨酸，含MspⅠ酶切位点（M⁺）的等位基因，PCR产物经MspⅠ酶切后可见到395bp和85bp的片段，不含MspⅠ酶切位点（M^-）的等位基因，PCR产物酶切后仍为480bp。

　　众多学者对ApoB基因RFLP_s与动脉粥样硬化之间的关系进行了研究。多数学者认为ApoE有XbaⅠ酶切位点（X⁺），无EcoRⅠ酶切位点（E^-），无MspⅠ酶切位点（M^-）的基因频率，在动脉粥样硬化性疾病的中比正常对照组高，但也有学者持不同甚至相反意见，究其原因，可能有以下几点：①研究样品例数不够，有的少于100个甚至少于50个，可能使一些有意义的联系被忽略；②对照组的选择没有统一的、严格的、明确的标准，有时与病员组缺乏可比性；③存在种族差异，例如XbaⅠRFLP基因频率，X⁺等位基因在高加索人为0.4～0.5,日本人和中国人则仅为0.04、0.01；④某些遗传标记之间可能存在连锁关系，可导致结论互不相同。

　　2．VNTR的检测

　　VNTR（数目可变的串联重复顺序）是继RFLP_s之后的又一类具有高度多态性的遗传标记，广泛分布于人类基因组中。ApoB基因3’端高变区（HVR）包含VNTR，由富含AT的DNA序列组成，其多态性特点是由10～15bp的核苷酸序列构成不同的等位基因，产生不同的重复序列拷贝数。以VNTR两侧特异性序列为引物，经PCR扩增后直接电泳分析产物，片段之间的差异在于AT重复次数不同，重复37次称为3β'37。依此类推，PCR引物可用以下序列：

　　VNTR-5’ ATGGAAACGGAGAAATTATG

　　VNTR-3’ CCTTCTCACTTGGCAAATAC

　　Boerwinkle等首先检测出12种等位基因片段，现有学者已检出22种不同等位基因。Frield等的研究发现，产生38、44、46或48个15bp长度重复序列的等位基因与冠心病、血浆胆固醇水平升高有关，且与EcoRi RFLP呈连锁不平衡，与MspⅠRFLP呈连锁平衡，Robinson等的研究则没有发现ApoB的VNTR多态性与血浆胆固醇、甘油三酯、ApoB等水平有关。

　　3．信号肽（SP）多态性的检测

　　ApoB基因5’信号肽（SP）由27个（插入型Ins）或24个（缺失型Del）氨基酸组成，可经PCR扩增后直接分析，用于PCR的引物序列为：

　　IN/DE-5’ CAGCTGGCGATGGACCCGCCGA

　　IN/DE-3’ ACCGGCCCTGGCGCCCGCCAGCA

　　Wu等报告del/del基因型在高胆固醇血症患者中比对照组中多见。Renges等对伦敦地区亚洲后裔的研究也发现带del基因型者血浆总胆固醇升高，但与冠心病无明显关系。Peacock等提出Ins/del多态性与冠心病的发展，即其严重程度有关，也有报道Ins/del多态性在冠心病与对照组中无明显差别。

　　三、ApoB基因多态性检测方法举例

　　以ApoB基因第26个外显子MspⅠ RFLP为例，具体介绍检测的方法和步骤，笔者对湖北地区健康成人（120例）进行了检测。

　　（一）材料

　　引物（如前所述），Taq DNA聚合酶、dNTP、限制性内切酶MspⅠ、高速离心机、基因扩增仪、恒温水浴箱、电泳系统、紫外监测仪。

　　（二）方法

　　1.模板DNA的提取

　　可采用改良的TritonX-100法提取人白细胞DNA，此法结果稳定，但操作较繁琐，在此采用改进的Na裂解法提取人白细胞DNA，简便、快速、灵敏、经济，步骤如下：

　　取EDTAN_a2抗凝血100μl，15000r/min离心5min，弃上层血浆，加无菌双蒸水200μl，摇匀20s，加6m NaI200μl，摇匀20s，再加入氯仿/异戊醇（24/1）400μl，摇匀后15000r/min离心12min，小心吸取上层水相，移入另一离心管，加0.6倍体积的异丙醇，混匀后4℃放置15min，15000r/min离心12min，弃异丙醇，加入70%乙醇洗涤2～3次，室温干燥，加入5μlTE缓冲液（pH=8.0）溶解DNA12～24h，4℃备用。

　　2．模板DNA的扩增

　　采用聚合酶链反应（PCR）。反应总体积50μl，MgCl₂终浓度为1.5mmol/L的1×Buffer,dNTp 0.2mmol/l，引物各20pmol,模板DNA约1.0μg，混匀，短暂离心，95℃预变性10min，加入Taq酶1.5U，液体石蜡50μl，短暂离心，按94℃ 45sec，60℃ 45sec,72℃1mim 15s循环30次，72℃延伸5min，置4℃贮存。

　　3．扩增产物的提纯及酶切

　　取扩增产物20μl，加入醋酸铵至2.5mol/L,与无水乙醇混匀，4℃沉淀15min，12000r/min离心10min，弃上清，70%乙醇漂洗两次，室温干燥后加入含Mspi 10U的缓冲液37℃保温2h，加入EDTA至10mmol/L终止反应。

　　4．扩增及酶切产物的检测

　　（1）琼脂糖电泳：制备2%琼脂糖（含0.5μg/ml EB），将扩增产物与标准DNA（PGEM3zf（+）/HaeⅢ）点样，电压4v/cm，电泳，紫外灯下观察。

　　（2）聚丙烯酰胺凝胶电泳：将扩增及酶切产物加样于8%聚丙烯酰胺凝胶上，电压6V/cm，电泳4h，EB染色，紫外灯下观察。

　　（3）结果：扩增产物经2%琼脂糖电泳，紫外灯下呈一条强荧光带，与已知DNa Marker相比较，约位于480bp的位置，与设计相符。

　　扩增产物经MspⅠ酶切后，在8%PAGE上，可见到三种类型：①原始带消失，出现两条新带，长度为395bp和85bp，为含酶切位点的M⁺M⁺纯合子；②酶切后除与扩增产物相同位置的原始带外，还有两条长度为395bp和85bp的带，共三条带，为M⁺M^-杂合子；③酶切后仅有一条带，与扩增产物位置相同，为无酶切位点的M^-M^-纯合子。

　　以上三种基因型，以含酶切位点的纯合型（M⁺M⁺）最多见，120例中有114例，不含酶切位点的M^-M^-型最少见，仅有1例，杂合型（M⁺M^-）有5例，根据基因频率计算方法，等位基因M⁺频率为0.97，少见等位基因M^-频率为0.03。

　　若对冠心病患者同时进行检测，计算基因频率，可见到：少见等位基因M^-在冠心病组比健康对照组高，有显著性差异，但无论在冠心病组还是健康对照组，各基因型个体间的血脂、脂蛋白、载脂蛋白水平均无显著性差异，这说明Apob MspⅠ多态性与冠心病有关，但与血中脂类水平的关系不明显，这可能是由于环境因素，激素及其他遗传因素对脂质水平的影响较明显，掩盖了Apob MspⅠRFLP对脂质的影响，也可能是这种多态性与ApoB基因上其他位点的多态性有连锁关系。另外，由于少见等位基因M^-的频率很低，有必要加大样本例数，进行进一步的研究。