第二节3H-TdR掺入法与MTT比色法

第二节　³H-TdR掺入法与MTT比色法

　　Cutbert等发现缺乏内源性和外源性胆固醇时，培养于仅含微量LDL营养液中的人外围血淋巴细胞，其生长和增生均依赖与细胞膜表面LDL-R的存在，根据一原理建立了³H-TdR（³H-thymidine,³H-胸腺嘧啶）掺入法检测人淋巴细胞LDL-R的活性。杨建新等改进了本法，减少用血量，但是未能避免使用同位素，简述止法。

　　检测原理：细胞分裂增殖所需的大量胆固醇主要通过内源性胆固醇合成，以及加速细胞膜LDL-R介导的特异性结合，摄取血LDL中的外源性胆固醇而获得，当用mevinolin(胆固醇合成的限速酶HMG-CoA还原酶的抑制剂)阻断细胞内源性胆固醇的合成，并使细胞外环境中LDL浓度降低至无非特异性外源胆固醇摄取时，细胞分裂生长完全取决与细胞膜表面LDL-R活性，掺入³H-TdR量与细胞生长成正比例关系。

　　实验方法：采空腹静脉血5～6ml，肝素抗凝，测血浆血脂，并分离出淋巴细胞；将细胞分成实验组（加含mevinolin的二甲亚矾）和对照组（加不含mevinolin的二甲亚矾），在同样条件下（50μg/mlPHA，5μg/mlLDL-C，37℃，5%CO₂，饱和湿度）培养96h，分别加入0.5μCi³H-TdR，混匀后继续培养6h，收集细胞至玻璃纤维纸上测cpm值。

　　其计算公式为：

　　淋巴细胞分裂抑制率（%）=（1-Δcpm实验组/Δcpm对照组）×100%

　　采用本法正常淋巴细胞分裂抑制率＜20%；FH杂合子淋巴细胞分裂抑制率＞60%，故可将FH与正常人以及普通的高脂血症区别开来。

　　MTT比色法是孟凡青等根据³H-TdR掺入法为避免使用同位素而改用四甲基偶氮唑盐（MTT）建立的快速、方便的方法。MTT比色法仅需采空腹静脉血1～2ml，培养90h后，实验组和对照组分别加入MTT溶液（3mg/ml），再培养2h，抽吸上清，加0.04mol/HCL-异内醇，充分溶解，在酶标仪上测吸光度（A）值。详细操作流程见图20-2。

图20-2 MTT比色法检测LDL-R操作流程

　　细胞分裂抑制率计算公式为：

　　淋巴细胞分裂抑制率（%）=（1-ΔA实验组/ΔA对照组）×100%

　　正常人淋巴细胞分裂抑制率为0～18%；FH杂合子淋巴细胞分裂抑制率为21%～58%；FH纯合子淋巴细胞分裂抑制率为36%～60%。

　　经实验比较MTT比色法与经典的³H-TdR掺入法测定的结果基本相符，但是后者敏感性更强，可以一步将FH杂合子和FH纯合子区分开来。由于MTT比色法不需使用昂贵的仪器和同位素，用血量少，适合一般实验室及临床检验科室的临床诊断，可用于人群FH筛查，这对于减少杂合子之间的婚配，降低FH发病率有重要意义。