第三节转基因小鼠模型与动脉粥样硬化

第三节　转基因小鼠模型与动脉粥样硬化

　　随着分子生物学的发展和脂代谢相关蛋白基因的克隆，序列测定及表达调控元件研究的深入，为探讨载脂蛋白及其他脂代谢相关蛋白和AS的关系，以期建立As TGM模型奠定了基础。现已对ApoAⅠ、AⅡ、AⅣ、B、CⅠ、CⅢ、E和Apo（a），以及LDL-R、CETP、LRP及LPL等进行了转基因动物研究，先后建立了各种TGM模型。为深入了解脂蛋白运输基因如何调控以及高表达与低表达在调控脂蛋白代谢中的主要作用和为研究脂蛋白代谢紊乱及AS等提供更好的实验动物模型。临床资料表明，脂蛋白代谢等紊乱与AS的敏感性密切相关，特别是各种Apo基因异常表达引起的高脂血症和AS以及各种Apo TGM在此领域的研究已是极其活跃与有价值。

　　Rubin等将人ApoA-Ⅰ基因导入，C57BL/6一鼠采用以评价转基因对饮食所致AS的影响时发现，表达人ApoA-Ⅰ的TGM其血浆所含人ApoA-Ⅰ和HDL浓度高于非转基因C57BL/6小鼠，人ApoA-Ⅰ基因表达可减少动脉窦泡沫细胞损害区域，这表明ApoA-Ⅰ基因表达伴随着HDL-C水平的提高可抑制AS的产生。因此，可应用ApoA-ⅠTGM探索高胆固醇饮食或Probucol等降血脂药物引起的HDL-C和ApoA-Ⅰ水平改变的机制。Williamson等发现ApoA-Ⅰ基因剔除鼠ApoA-Ⅰ水平低下并伴有HDL-C低下，而表达人ApoA-Ⅱ的TGM，其HDL-C并不增加，小鼠原有的ApoA-Ⅰ和A-Ⅱ也不减少。这也是临床上所见到血浆Apo量与HDL-C之间无相关性的证据之一。研究TGM可发现ApoA-Ⅱ与影响HDL量的ApoA-Ⅰ不同，它主要影响HDL的质。Schultz等将分别表达人ApoA-Ⅰ和A-Ⅱ的TGM杂交后发现，同时表达ApoA-Ⅰ、A-Ⅱ基因的TGM抑制AS形成的能力弱。同时也说明并非所有HDL颗粒都有抗AS作用。

　　已有报道P₁噬菌体文库中分离出含有5’端（19kb）和3’端（14kb）侧翼序列在内的整个ApoB₁₀₀基因（约43kb）的人ApoB克隆。将其导入小体内发现这种TGM血浆中人ApoB₁₀₀水平显著增加。另外人ApoB₁₀₀基因转录在小鼠体内能被有效地剪辑。分析ApoBTGM脂蛋白谱发现与人相似，含有高水平LDL-C。这一模型有助于高胆固醇血症与低β脂蛋白血症等发病机理的研究。

　　研究ApoC-ⅢTGM发现小鼠血浆甘油三酯（TG）水平随ApoC-Ⅲ转基因的表达增加而增高，通常TG含量比正常小鼠高二倍以上。因此ApoC-ⅢTGM是第一个人为原发性高TG的动物模型。有推测认为高TG血症的形成，一是因为VLDL在体内滞留时间延长而非残余颗粒累积所致，二是由于改变了Apo表面组成或/和游离脂肪酸升高所引起。这些研究提示ApoC-Ⅲ基因的表达能调节人体TG水平，人ApoC-Ⅲ基因过量表达促进AS的形成。

　　Shimano等通过把大鼠ApoE基因与金属硫蛋白启动子一起导入小鼠体内，所制备的TGM血浆ApoE水平是正常对照组的4倍，并可观察到VLDL和LDL-C的急剧下降。此外，这种TGM对饮食所致高胆固醇血症具有耐受性。ApoE结构基因位点存在多态性。在若干变异型易形成Ⅲ型高脂血症（HLP），故这一模型期望能用于Ⅲ型HLP发病机理的研究。近年运用基因打靶与基因剔除技术已成功地制备出一类新的ApoETGM模型。Plump等发现缺失ApoE基因的TGM血浆LDL和VLDL水平均显著高于正常对照组，HDL水平则低于正常小鼠。Paszty等研究发现，表达人ApoA-Ⅰ且HDL含量高的ApoE基因剔除小鼠比不表达人ApoA-Ⅰ且HDL含量低的ApoE基因剔除小鼠难以形成AS。

　　Chiesa等通过把鼠转铁蛋白启动子与Apo（a）cDNA相连接，导入小鼠体内制成Apo（a）TGM。转基因最初在肝脏表达，并在脑、睾丸、心脏和肾脏中可检出少量Apo（a）mRNA和蛋白质。Apo（a）TGM动脉窒亦可见明显损害，这提示Apo（a）本身就可致AS，其作用待探讨。Callow等将过度表达ApoB的TGM与表达Apo（a）的TGM进行杂交，制备出能同时表达人ApoB与Apo（a）的TGM。这种TGM能有效地装配出与人血浆Lp（a）颗粒非常相似的Lp（a）分子。Liu等研究ApoA-Ⅰ与Apo（a）转基因表达间的相互关系时发现，仅表达Apo（a）的TGM与对照组小鼠脂蛋白谱相似，而其对饮食诱导所致的AS敏感性显著增加。同时表达Apo（a）与ApoA-Ⅰ的TGM其HDL浓度是仅表达Apo（a）的TGM的2倍，而其形成早期AS斑块的可能性仅为前者的1/20。由于Lp（a）是AS发病的独立危险因子，而Apo（a）与纤溶酶原（PLG）具有高度同源性，故Apo(a）TGM是研究Lp(a)发病关联方面非常有意义的动物模型。

　　糖尿病、肾病等疾病与心血管疾病并发症密切相关。近年来有关这些疾病的转基因动物模型也相继建立。Allison等曾以大鼠的胰岛素启动子调节小鼠第一类组织相溶性抗原复合物（MHC-1）基因，在TGM的胰岛β细胞表达，引起胰岛异常，胰岛素分泌降低从而建立了胰岛素依赖型糖尿病（IDDM）TGM模型。Marban等将8.8kb的胰岛素基因注射到小鼠受精卵原核，培育出高胰岛素血症TGM模型。Mackey等报道用SV₄₀早期区基因进行转基因动物研究，建立了肾小球硬化和肾囊肿TGM模型。Doi等通过生长激素和生长激素释放因子的TGM研究，建立了进行性肾小球硬化TGM模型等。随着转基因技术的不断完善，人类疾病的的转基因动物模型不断涌现，为攻克心血管疾病提供了可选择性的动物模型与研究手段。

　　展　 望

　　虽然转基因动物（尤其是TGm ）这一生命科学研究的新体系引入到心血管疾病研究领域只有短短十年时间，但已取得了惊人的成果。转基因动物模型在脂代谢障碍与AS病因和发病机理中的研究应用仍然方兴未艾。例如：运用日益成熟的各种转基因技术建立更多的与脂代谢相关的TGM系动物模型；由仅研究含与脂代谢紊乱有关的基因的TGM转向研究含有几种基因的TGM研究；运用基因打靶与基因剔除技术研究缺失基因对AS生理功能的影响；运用成熟的TGM研究各种基因的表达调控；如何将转基因技术（如基因剔除）运用于心血管疾病的基因治疗；利用成熟的转基因技术，建立我国自已的转基因和缺基因动物系列，并使用这些这动物心血管疾病发病机理等方面都有待进一步研究探讨。

　　利用转基因方法建立人类疾病动物模型和用其他方法相比具有许多优点。诸如遗传背景清楚，遗传物质改变简单，建立的模型更自然和更接近病人症状；建立过程操作简便，周期短，而且建立的转基因动物模型不需要特殊的饲养条件即可保持疾病症状，按照孟德尔规律代代相传，维持费相对较代等，但是由于转基因方法和技术上的原因，目前转基因动物模型仍存在一定的问题。譬如有时转基因动物模型缺乏典型的像病人那样的症状；外源基因插入宿主基因组而引起插入突变，破坏宿主基因组基因而产生异常，甚至导致转基因动物的不育和死亡；外源基因在宿主动物染色体上整合的拷贝数不等，单位拷贝的外源基因表达水平不均一，给外源基因的表达控制带来困难；症状严重的还易早死；外源基因在宿主染色体上的部分整合导致外源基因的不表达，不出现预期的严重的还易早死；外源基因在宿主染色体上的部分整合导致外源基因不表达，不出现预期的症状或与预期的结果不符合；有时还会出现整合的外源基因遗传丢失而导致转基因动物模型症状的不稳定遗传等。

　　分子生物学的迅速发展，导致转基因技术的出现和转基因动物的形成，从而建立了一类新的动物模型，可用于各个领域，各种目的的研究。尽管人类疾病转基因动物模型仍然存在一些问题，但随着转基因技术的不断完善，理想的转基因动物模型必将明显增多。动脉粥样硬化是一复杂多因素引发的疾病，涉及到环境、遗传等因素的作用，也是人类死亡的主要原因之一。转基因动物作为一种新的研究工具与实验手段，在现代生理学、遗传学，药物学、生物化学与分子生物学等学科研究的配合下，必将更有助于人们找出早期诊断心血管疾病的方法，寻找新的治疗途径与对策。

（鄢盛恺）

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