第十九章载脂蛋白表型及基因型的检测--第一节载脂蛋白（a）表型

第十九章　载脂蛋白表型及基因型的检测

　　蛋白质多态性（protein polymorphism）指蛋白质存在多种不同的变型，些变型的产生是由于同一基因位点内的突变，产生复等位基因，导致合成不同类型的蛋白质，人类蛋白质的多态性往往和人种及其地理分布有关。在已发现的近20种载脂蛋白中，ApoAⅠ、AⅡ、AⅣ、CⅡ、CⅢ、E及Apo（a）等存在明显的多态性，这些载脂蛋白可以以分子大小/电荷互不相同的多种形式存在。彼此互称异构体（isoform）。多态性反映了载脂蛋白结构的不均一性。

　　载脂蛋白表型（phenotype）指载脂蛋白的基因型与发育的环境相互作用而产生的个体的可观察到的性状。一般可分为纯合子（homozygous）与杂合子（heterozygous）两大类，分别由一种或几种异构体构成。通常应用等电聚焦（IEF）、十二烷基硫酸钠-聚内烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、双向电泳等电泳技术，或者结合免疫印迹技术，或者以分子生物学等方法检测载脂蛋白表型及基因型。

第一节　载脂蛋白（a）表型

　　Apo（a）是一结构复杂的糖蛋白，Lp（a）特征性的蛋白成分，占Lp（a）的20%。Apo（a）含糖量30%～35%，通过一个或多个二硫键与ApoB100相连。Apo（a）分子量在250000～800000之间，是目前所发现的最具多态性的人类蛋白质。Apo（a）多态性产生的原因在于其肽链长度不等而且糖基化程度不同；这是由于Apo（a）基因中Kringle-4结构重复的数量差异所致，在不同个体中重复10～40次不等。

　　起初Utermann等通过家系研究发现Apo（a）多态性受Apo（a）基因位点上的一组等位基因所控制，认为这种多态性以常染色体显性方式遗传。近来运用限制性片段长度多态性（RFLP）等方法证明Apo（a）是以孟德尔共显性方式进行遗传的。随着检测方法的改进，报道控制Apo（a）多态性的等位基因数目越来越多。目前已发现Apo（a）等位基因位点中至少有34个等位基因与其多态性有关。鉴于高Lp（a）是心脑血管疾病（CCVD）的独立危险因子，与Apo（a）作用密切相关。故检测Apo（a）多态性表型在不同人群中的分布对CCVD的预测及防治具有重要意义。

　　一、Apo（a）表型检测的方法学

　　Apo（a）表型检测方法主要有两大类，一类应用SDS-PAGE分离载脂蛋白，然后结合免疫印迹技术检测不同Apo（a）表型；另一类方法的不同之处在于用SDS-agarose（琼脂糖）电泳代替SDS-PAGE分离载脂蛋白，使检测分辨率大为提高。

　　Utermann等（1987）应用-SDS垂直板PAGE结合免疫印技术，检出6种Apo（a）异构体，共14种临床表型。应用此法仅有50%受试者可检出Apo（a）异构体区带，Kraft等（1988）将上法垂直板电泳槽改为水平板式，避免了带型之间污染问题且使方法更适合于大批量标本检测。Huang等（1991）将生物素-亲和素放大技术引入Utermann法免疫印迹检测系统，使检测灵敏感大大提高，88%的受试者均可检出Apo（a）异构体区带。1990年Gaubatz等应用含0.75%agarose的SDS-PAGE结合免疫印迹技术，发现美国人中共有在11种Apo（a）异构体，共32种表型。仅有1%受试者未检出任何一种Apo（a）异构体。

　　Kamboh等（1991）报道应用SDS-agarose电泳结合免疫印迹技术检测Apo（a）表型的方法，检出23种不同Apo（a）异构体，共115种表型。Geroldi等（1993）将Kamboh法加以改良，以毛细管印迹（capillary blottiog）代替传统的电转移法，并用聚偏二氟乙烯（PVDF）膜代替传统的硝酸纤维素（NC）膜，使检测方法更为简便、经济，更适合于大规模人群调查。Marcovina等（1993）应用SDS-1.5%agarose凝胶电泳结合免疫印迹技术，首次报道人类至少有35种Apo（a）异构体，此法是在Kamboh等法基础上发展起来的一种高分辨的新分析方法。

　　上述两类方法有许多相似之处，即首先采用电泳技术将Apo（a）与其他载脂蛋白分离，然后应用转移免疫印迹技术（Western immunoblotting），灵敏而特异地显示Apo（a）多态区带的位置，最后根据其与ApoB100电泳速率比较或根据其分子量大小而确定Apo（a）表型。

　　二、SDS-PAGE结合免疫印迹法检测Apo（a）表型

　　检测Apo（a）表型的方法中，以Utermann法或其改良法最为常用。这类方法先用SDS-PAGE分离Apo（a）异构体，然后用特异的多克隆或单克隆抗体作免疫印迹显示。

　　1．仪器与试剂

　　电泳仪，夹心式垂直板电泳槽及凝胶转移电泳槽，NC膜（孔径0.45μm,转移电泳用）；高分子量系列蛋白标准（MW67000～669000，Pharmacia产品）；ApoB100纯品；主要试剂有：①30%丙烯酰胺贮存液；②电泳缓冲液为pH8.3，内含0.1%SDS的0.025mol/l Tris-0.192mol/L甘氨酸溶液；③转移电泳缓冲液为pH8.3，内含20%甲醇的0.02mol/l Tris～0.15mol/L甘氨酸溶液；④样品处理缓冲液：50g/l SDS水溶液4ml，β-疏基乙醇800μl，750ml/L甘油溶液800μl ，10g/L溴酚蓝溶液200μl混合；⑤洗涤缓冲液为pH7.4内含9g/L的0.01mol/l Tris-HCl溶液；⑥封闭液为内含50g/L去脂奶粉（或含10g/L小牛血清白蛋白）的洗涤缓冲液；⑦第一抗体为羊抗人Apo（a）血清；⑧第二抗体作为辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG；⑨底物溶液为脂溶性4-氯-1-萘酚底物液或水溶性二氨基联苯胺（DAB）底物液。

　　2．实验方法

　　①凝胶板制备：按照说明书安装好垂直板电泳槽，参照Utermann等方法配制6.6%聚丙烯酰胺分离胶和3.6%浓缩胶制备胶板；②电泳：血清样品18μl与100μl新鲜配制样品处理缓冲液混匀，置100℃水浴10min，冷却，取此混合物20μl加入样品槽中并覆以电泳缓冲液，ApoB100与高分子量蛋白标准处理，除不加β-巯基乙醇其他操作同前。在上下槽注入电泳缓冲液，接通电源（上槽按负极，下槽接正极）待溴酚蓝跑出凝胶下沿2h即可结束电泳（通常120V电泳6h）；③转移电泳：取此凝胶，切下分子量蛋白带放入SDS洗脱液中过夜，以固定凝胶大小并洗脱掉未与蛋白结合的SDS，0.01%考马斯亮蓝G-250染色室温1h，7%乙酸脱去背景颜色。剩余凝胶铺在已浸过转移电泳缓冲液的NC膜上，在凝胶NC膜外再覆以3mm厚的滤纸（预先用转移电泳缓冲浸湿），将此滤纸/凝胶/NC膜/滤纸一同放在电泳转移支架上，按层次相夹置于装满转移电泳缓冲液的电泳槽中，接通电源（凝胶面对负构，NC膜面对正极）。120V电泳6h（30℃以下）或4℃30V转移过夜；④免疫印迹分析：取出转移后的NC膜在洗涤液中洗3次后，置封闭液中室温封闭3h（或37℃1h），在洗涤液中洗3次，加入1：100稀释的第一抗体并充分混匀，37℃温浴6h（或过夜），随后用洗涤液洗5次（10min×5）甩干。加入1：500稀释的第二抗体，混匀，37℃作用2h，洗涤同上。加入新配制的底物溶液于室温下摇动直至出现紫色（或紫褐色）并看到背景（1～5min）时用蒸馏水冲洗终止反应，空气干燥封于塑料袋中避光保存；⑤Apo（a）表型判定：量出Apo（a）蛋白带中心距分离胶界面的距离，对照ApoB100和高分子量标准的泳动距离，确定Apo（a）带型及各表型的分子量范围。在SDS-PAGE中蛋白质的迁移速度主要取决于它的分子量大小而与其形态及所带电荷多少无关。用巯基乙醇打开Apo（a）与ApoB100之间的二硫键，Apo（a）的分子量即可通过与蛋白标准比较相对迁移率的办法而求得。并按其与ApoB100在凝胶中迁移速率的快慢而将其分为F（较ApoB100快），B（与ApoB100相似），S1、S2、S3、S4（依次较ApoB100慢）6种多态异构体并组合成各种Apo（a）表型，见图19-1所示。

图19-1 几种Apo（a）表型的免疫印迹分析示意图谱

　　3．实验条件的优化

　　在此方法中，聚丙烯酰胺凝胶起着载体和分子筛的双重作用，不同浓度的凝胶适于不同分子量的蛋白质分离，国外用于Apo（a）表型测定的凝胶浓度差异较大（3.25%～7.5%）,经过对此实验发现，分离胶选用6.6%较为适宜，其操作方便，分离效果也较好。分离和转移电泳都会因产热而影响实验效果。而国产电泳槽冷却装置效果较差。为解决这一矛盾，除选用诸如Bio-Rad产垂直板电泳槽及转印槽（Model 220 dual vertical-slab gel electrophoresis cell,TransblotTm cell；Bio-Rad Labs；Richmond,CA）外，可采取降低电压延长电泳时间和4℃环境中电泳的措施，也可取得较好效果，免疫印迹反应中也可选用鼠抗人Apo（a）单克隆抗体作为一抗，用酶标兔抗鼠IgG作为二抗。应用酶标抗体反应作为二抗时，底物以脂溶性4-氯-1-萘酚或联茴香胺较水溶性DAB溶液为好，也可用金标、I125标抗体作为二抗，通过银染或放射自显影技术显示Apo（a）蛋白区带，但此类方法已较少使用。将生物素标记的抗体作为二抗，通过生物素-亲和素系统放大信号，可大大提高检测敏感性。血清标记贮于4℃一周或贮存于-80℃一年内仍可检出Apo（a）遗传表型。Kamboh等介绍的方法多采用标准蛋白分子量定型法确定Apo（a）异构体。Sandholzer等报道，Apo（a）6种异构体分子量分别为F：＜400000，S1≈520000，S2≈580000，S3≈640000，S4＞700000，国外现已有Apo（a）表型测定标准物（含异构体F、S1～S3-ImmunoAG、Austria），可用于Apo（a）异构体判定及质控。分子量标准除采用凝胶染色外，也可将分子量标准蛋白转移电泳至NC膜上，切下非特异性转移带（即标准部分）用低浓度CBBG-250或氨基黑10B染色法染色，并记下标准的位置。

　　三、Apo（a）表型检测的临床意义

　　临床上对Apo（a）多态性研究是从80年代开始的。近十年来，国内外学者通过分析不同Apo（a）多态在不同种族正常人、冠心病、高脂血症、脑血管病、糖尿病等人群中的分布，以及对高脂血症家系调查，得出下述一些结论：

　　1．Apo（a）表型对于每个研究个体来说是终生固定的，不因身体状况而改变。Apo（a）表型受遗传基因控制，其遗传遵循孟德尔遗传规则，即个体中出现的Apo（a）多态总存在其双亲中。

　　2．Apo（a）表型以一种异构体构成的单一表型为多（以S4较多见）；最多由两种Apo（a）异构体构成同一血清表型，此类双表型以S2/S3为多见，正常人群中较常见的Apo（a）表型为S4、S3、S2、B、S1少见；F罕见。亚洲人群S4较欧美人群频率明显增高，说明Apo（a）多态性可能存在一定种族差异性。

图19-2 Apo（a）异构体分子量，人群中出现频率和血清Lp（a）水平

　　3．Apo（a）异构体分子量与其血清Lp（a）浓度呈负相关。即高分子量Apo（a）表型伴低Lp（a）浓度，低分子量Apo（a）表型伴高Lp（a）浓度，见图19-2所示。

　　4．冠心病(CHD)与正常人Apo（a）表型频率分布具有显著性差异，双表型频率明显高于正常人,伴高Lp(a)水平的Apo（a）表型B、S1和S2频率也显著高于正常人。同种表型者，冠心病组血清Lp(a)水平多高于正常对照组。国内秦树存等研究认为，Apo（a）低分子量表型（B、S1、S2）与高水平的Lp（a）密切相关，为我国汉族人群中CHD的独立的遗传危险因素。庄一义等研究发现Apo（a）研究表型在心脑血管疾病（CCVD）患者与正常对照组之间的分布存在明显差异，伴高水平Lp（a）的表型B、S1在CCVD组中出现的频率（19%）高于对照组（5.7%）；相反，伴低水平Lp（a）表型S4和未检出（null）在CCVD组中出现频率（36.2%）,低于对照组(51.9%)。

　　5．研究证明，Ⅲ型高脂血症（HLP）、周围血管性疾病（PVD）、晚期肾病（ESRD）、糖尿病等患者Apo（a）表型频率分布与正常人均无显著性差异，但血清Lp（a）浓度显著高于正常人。一般高分子量表型（S2、S3、S4）患者血清Lp（a）水平高于同表型正常人。这些资料显示，除Apo（a）基因多态性明显影响血清Lp（a）水平外，一些非遗传因素（如环境、性激素水平等）和/或其他遗传因素对Lp（a）水平也有影响。