第三节血浆脂蛋白电泳分离定量法

第三节　血浆脂蛋白电泳分离定量法

　　一、血清脂蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳

　　（一）原理

　　以聚丙烯酰胺为支持介质，血清脂质用染料预染，使脂蛋白着色，经电泳后，一般可分出三条区带，即β-、前β-、α-脂蛋白。并可用光密度扫描仪检测其相对百分数，乘以总脂量，可求出三种脂蛋白的含量。

　　（二）试剂与仪器

　　1．试剂

　　（1）分离胶缓冲液：三羟甲基氨基甲烷（Tris）18.3g,lmol/L盐酸24ml，加水至100ml(pH8.9)。

　　（2）丙烯酰胺Ⅰ液：丙烯酰胺（Acr）15g，甲叉双丙烯酰胺（Bis）0.4g，混匀。

　　（3）0.35%过硫酸铵（AP）

　　（4）四甲基乙二胺（TEMED）

　　（5）丙烯酰胺Ⅱ液：Acr10g、Bis2.5g、加水至100ml，混匀。

　　（6）浓缩胶缓冲液：Tris 6g、1mol/L HCl。

　　（7）0.002%核黄素，48ml，加水至100ml，pH6.7。

　　（8）电极缓冲液：甘氨酸2.88g、Tris0.6g、加水至1000ml，pH8.3。

　　（9）1%苏丹黑B染色液：苏丹黑B200mg，丙二醇20ml，水浴加温至溶，离心，去除沉渣，冰箱保存备用。

　　（10）40%蔗糖水溶液。

　　2．仪器

　　电泳仪、光密度扫描仪

　　（三）操作

　　1．制胶

　　（1）先准备清洁的0.5×7.5cm玻璃管，封口底。

　　（2）配制5%浓度凝胶：取丙烯酰胺Ⅰ液5ml，分离胶缓冲液5ml及Ap液10ml混合，再加TEMED，20μl，混均，用吸管注入每支玻璃管内使胶柱长约4cm，上层用蒸馏水沿管壁仔细加水到凝胶表面，千万别冲散凝胶界面，使凝胶与空气隔绝。静置20～40min，等凝胶凝固后，除去上层水，再加上浓缩胶。

　　（3）浓缩胶制备：取丙烯酰胺Ⅱ液1.0ml、浓缩胶缓冲液0.5ml、核黄素液0.5ml和水2ml混匀，加TEMED20μl混匀，迅速加入到分离胶上层约1cm高度，沿管壁仔细加蒸馏水覆盖，千万别冲散凝胶界面。置日光灯处聚合30min，也可在强光下聚合，聚合好的浓缩胶呈淡乳白色。凝胶可置4℃冰箱备用。

　　2．血清预染与加样

　　在0.25ml血清中加入1%苏丹黑B染色液0.025ml，摇匀，于37℃水溶保温45min。离心除去沉渣，取预染血清30μl，加在聚合好的倾去水层的浓缩胶表面，再加一滴40%蔗糖液，混匀，然后小心地在上面加满电极缓冲液，再装在电泳槽上。

　　3．电泳

　　将电极液加入上下电泳槽内，靠样品端的上槽接负极，下槽为正极，接通电源，调节电流为2-5mA/管，30～40min后，关闭电源。

　　4．剥胶

　　从电泳槽上取下凝胶管，用带长针头的注射器吸水注入凝胶与玻管内壁之间，使凝胶与玻管内壁分离，再用吸耳球推出凝胶。根据不同型号的光密扫描仪，凝胶扫描或者将装有凝胶的玻管直接扫描定量。

　　电泳后凝胶一般出现三条区带，从正极到负极依次为α-脂蛋白，β-脂蛋白和前β-脂蛋白，前β-脂蛋白处于浓缩胶和分离胶之间。

　　5．定量

　　浆凝胶或连同玻管一道置于光密度计扫描仪上进行扫描，计算每个峰的面积占各峰之和和总面积之比，即为每种脂蛋白组份的百分比。

　　二、血清脂蛋白琼脂糖电泳法

　　（一）原理

　　以琼脂糖凝胶为支持介质，先用脂类染料将血清进行预染，使血清脂蛋白着色，然后电泳。切下各脂蛋白区带，加热溶解，冷却后比色。或者用光密度计直接扫描仪定各区带。计算出α、β-和前β-脂蛋白的相对百分比。

　　（二）试剂

　　1．巴比妥HCl缓冲液（pH8.6，离子强度0.075）：称取巴比妥钠15.5g，加入1mol/LHCl12ml，混匀溶解，加蒸馏水至1000ml，此为电极缓冲液。

　　2．巴比妥-HCl缓冲液（pH8.6,离子强度0.05）：称取巴比妥钠10.3g,加入1mol/L HCI8ml，混匀溶解，加蒸馏水至1000ml，用于配琼脂糖凝胶用。

　　3．0.8%琼脂糖凝胶：取琼脂糖0.8g，溶于配琼脂糖凝胶的缓冲液100ml，置沸水煮溶或置于微波炉中热溶解。

　　4．1%苏丹黑B的石油醚-乙醇（1：4，V/V）溶液。

　　（三）操作

　　1．预染血清：吸血清0.2ml于一小试管中，再加苏丹黑B染色液0.02ml及无水乙醇0.01ml。混匀后置于37℃水溶预染20min。取出各管，2000r/min离心5min，以除去多余的染料。

　　2．琼脂糖凝胶板制备：将0.8%琼脂糖凝胶溶解后，吸2.5ml到载玻片上，趁热将刻点样槽用有机玻璃盖放在距载玻片一侧近1cm处。一块载玻片前后可打两个槽点两份样品。

　　3．点样与电泳：取下凝胶上有机玻璃盖并显出一加样小槽。取预染血清40μl，注入此小槽中。在电泳槽内加入巴比妥电极缓冲液，样品端为负极。以四层滤纸或沙布搭桥按10V/cm电泳，待预染血清电泳至最高或40min，切断电源。

　　4．定量：

　　（1）切割比色法：将凝胶板上各脂蛋色带分别切开置于装入有3ml蒸馏水的试管内。切相应大小的空白琼脂糖放入3ml蒸馏水试管内，为空白管，各管放入沸水煮3min，琼脂糖溶解，待冷，以空白管调零点，于660nm处比色，记录吸光度，以α-、前β-和β-脂蛋白三条区带吸光度总和，比各自区带的吸光度，求其百分比。种半定量方法不够准确，误差很大。

　　（2）扫描定量：预染脂蛋白琼脂糖凝胶电泳毕，其琼脂糖凝胶板上有色带，可直接置于光密度扫描仪扫描，并得出各区带的百分比，如果输入该病人的血脂总量，即可算出α-、前β-和β-脂蛋白的各自含量，如图16-2所示。

图16-2 血清脂蛋白电泳（琼脂糖）

　　正常参考值（百分比）：

　　α-脂蛋白 25.7±4.1%

　　前β-脂蛋白 21.0±4.4%

　　β-脂蛋白 53.3±5.3%

　　注意事项：①血清样品要新鲜；②为了免去离心步骤，吸取预染血清时，应吸取上层，下层或管底可能有染料颗粒沉渣，否则应再离心后吸预染血清。