第三节酶活性测定条件的选择和限定

第三节　酶活性测定条件的选择和限定

　　引言中已强调了仅在一定条件下酶反应速度v才和酶量成正比例。一定条件是什么？些条件之间有无主次关系？如何选择合适的测定条件？这些都是实验室工作者在设计或选择测酶活性浓度方法时必须面对的问题。

　　首先可从理论上探讨在什么特定情况下的反应速度才可能与酶量成正比例。酶的整个反应过程可简化如下：

　　式中Kp可看成为ES的解离常数.Michaclis和Menten通过推导可得出下式方程式

　　此式中V为最大反应速度，对一定浓度的酶而言为一常数。Km为实验室工作所熟系的米氏常数。上式也可改写为：

　　Kp和Km虽为常数，但[S]为变量，因此在一般情况下不可能为常数，即v≠k[E]，从理论上很清楚说明反应速度v和酶量E之间在绝大多数条件下只存正比，即v∝[E]。而非正比例关系。但在底物[S]浓度很大，远远超过Km的特殊条件下Km值由于相对很小可忽略不计。此式可变为：

　　由于底物[S]浓度很大，使酶饱和。ES已达极限，反应速度不再增加，故此时反应速度为最大反应V。即从理论上说只有测定的是酶最大反应V。此时反应速度才和酶量E成正比例。也只有在此基础上建立起来的测定方法才是可靠的、准确的。

　　Kp是酶学中很重要的一个常数，即周转数（Turnover number），从上式可得出。

　　其含义为每分钟每分子酶转换底物分子数。酶的Kp数值约在50-105min^-1之间。碳酸酐酶是已知最高酶变率的酶（36×10^-6min^-1）。Kp的倒数代表每一酶催化循环的时间，以碳酸酐酶为例

　　1/Kp=lmin/136×106＝0.028×10^－6min＝1.7μs

　　即每隔1.7μs，一分子酶就和一个底物结合，反应一次。

　　国际临床化学联合会（IFCC）和不少国家包括我国的一些学会建立了或正在建立测定酶活性浓度的推荐或参考方法。都毫无例外地提出测酶活性浓度方法所选择的测定条件应是酶反应的“最适条件”以保证酶具有最大的催化活性。实质上就是基于以上理论考虑，要测定酶的最大反应速度V。

　　我国检验学会文件中对最适条件是这样提出：①选合适的底物、辅因子、活化剂、变构剂的种类和浓度。②指示酶和辅助酶的种类和浓度。③反应混合液的最适pH，缓冲液种类和浓度。④其它影响酶活性的因素，如去除各种抑制剂。并提出：在某些情况下，为了获得更好的测定重复性或更大的临床价值，可考虑对上述“最适条件”作适度的修改。

　　一、底物、辅因子、活化剂、变构剂的种类和浓度

　　这一项包括几种因子，其中最重要的是底物种类和浓度，这是每种测酶活性浓度方法中首先需要选择的项目，选择恰当与否，对该酶测定至关重要。后面几项则不是每种酶测定都会遇到的选择。

　　（一）选合适的底物种类和浓度

　　如所测的酶专一性不强，可作用于多种底物，首先就需决定选择哪一类底物作为测此酶的底物。如该项酶测定主要用于临床诊疗工作，则首先应考虑选有较高诊断价值的底物。例如临床上测定酸性磷酸酶主要用于诊断前列腺癌，所选的底物应对前列腺酸性磷酸酶有较高的特异性。不易被其它组织如红细胞、血小板中酸性磷酸酶所作用，在常用的底物中以麝香草酚磷酸盐最符合上述选择条件。但如进行酶基础研究，探讨其在体内作用时，则选择酶在体内的生理底物更为合适，一般而言在多种底物中，Km最小的底物往往是此酶的生理底物。

　　选择Km小的底物测定酶还有一个优点，就是在最大反应速度V的底物浓度也将最低。在实际工作中可能意味着试剂成本可能较低，不易出现底物难溶解的困难。

　　底物专一性强的酶虽然不面临上述选择，但只要所测酶催化的是可逆反应，则和专一性不强酶一样，都面临着是选择正向还是逆向反应来测定酶，不同反应方向的底物必然是不一样的。这方面的选择更多从技术和实用方面加以考虑往往选择速度较快的方向，因为这可以提高测定的灵敏度，如测定肌酸激酶（CK），由于磷酸肌酸价格昂贵且不稳定，早期多选用正向反应，底物为肌酸和ATP速度太慢，只是逆向反应的1/6，测定灵敏度太低，以致正常标本结果误差很大。近年来都改用逆向反应测定CK，明显提高CK测定的精密度和准确度。在此问题上，实用考虑也起了不小作用。例如测定乳酸脱氢酶（LD）时，如考虑到正向反应明显快于逆向反应，则应考虑以丙酮酸和NADH为底物，这正是IFCC和其它一些学会推荐的方法。但目前市售的测LD的试剂盒不少都以乳酸和NAD＋为底物。因为NAD＋价格明显低于NADH，并且稳定可长期储存。科研工作中如需测LD，还是最好采用IFCC的方法。

　　确定底物种类后，重要的问题是选择底物的合适浓度，在讨论此问题之前，有必要先简单复习一下底物浓度和酶反应速度之间的关系，因其不同于其它化学反应有其独特之处，图17-2很形象表示出这种差异。

　反应物浓度[S]
图17-2a 反应物浓度对化学反应的影响

底物浓度[S]
图17-2b　底物浓度对酶反应的影响

　　图a表示在一般化学反应中遵循质量作用定律，反应速度随反应物质浓度增加成正比例增加，图b则表示酶反应中底物浓度对反应速度的影响，当底物浓度很低时，酶反应速度几乎随底物增加成正比例加快，进一步升高底物浓度，虽然反应速度也加快，但增加速度愈来愈慢，不成比例。到一定程度，反应速度趋于恒定为一常数，实际上就是趋向最大反应速度V，测定此处的反应速度V，最能准确地反映酶量多少。在此处底物浓度变化，对反应速度影响很小。

　　Michaclis和Menten二式首先在本世纪初对酶反应的此项独特现象从理论上加以合理解释。并推导出著名的米-门方程式：

　　此公式对选择酶测定的底物浓度有重要的指导作用。Km对每酶而言在一定条件下为一常数，并可从上述方程式求出，在反应速度为最大反应速度V一半时，代入上式得：

　　Vkm＋V[S]＝2V[S]

　　VKm＝V[S]

　　[S]＝Km

　　换言之，当酶促反应速度为最大反应速度一半时，此时的底物就相当于酶的米氏常数Km。以mol/L表示之，大多数酶Km在10^-3至10^-5mol/L之间。

　　当我们知道或计算出某一酶的Km后就可以计算出不同底物浓度和Km间的比值，化入米-门方程式就可计算出此时酶促反应速度相当于最大反应速度的百分比，见表：17-3

表17-3　底物浓度与Km比值相当的最大反应百分比

　　依据上表一般都认为酶测定时底物浓度最好为Km的20倍乃至100倍。在实际工作考虑到底物溶解度的限制，价格的昂贵，可将底物浓度降为Km的10倍。再低就不适合酶的测定，可能产生较大误差。

　　以上规律适用于大多数酶。一些酶还有其特殊情况，常能遇到的是当底物浓度增加到一定范围后，酶反应速度不仅不增加，反而下降。如乳酸脱氢酶，当丙酮酸浓度超过一定量时，酶活性反而下降，故丙酮酸浓度不能过高。

　　以上介绍的米-门方程式只适用于单一底物的酶，不少酶催化反应二底物乃至更多底物，有关二底物的米-门方程以及此时底物浓度的选择可参考一些有关书籍。实际工作中最简单的作法是先将其中底物之一的浓度选得很高，使酶饱和，然后求出另一底物的表观Km，反之亦然，最后按上述规律决定二底物的合适浓度。

　　（二）辅因子、活化剂的种类和浓度

　　从广义上说，凡能促进酶及反应物进入活化状态从而加速酶催化反应的物质都能称为辅因子，它包括种类很广的物质。英汉生化词典将辅因子（cofactors）定义为“一种酶的活性所需要的一种非蛋白质成分”。这种辅因子可能是一种金属离子激活剂或一种有机分子（辅酶）。它们或松或紧地与酶相结合；紧密接合的辅因子称为“辅基”。将激活剂（activator）定义为“一种金属离子，作为一种酶的辅助因子。”

　　在前面已谈到，测酶活性浓度时应该在最适条件下测酶反应的最大速度。如测定酶需要辅因子，活化剂时，应选择合适的种类和浓度加入到测定酶的体系中，在些过程中可能会涉及到下列四类物质。

　　首先是辅酶（Coenzyme）。很多酶反应都必须有辅酶参加。如相当部分的还原酶需要辅酶Ⅰ（NAD＋）和辅酶Ⅱ（NADD＋）参加。ATP是激酶（Kinase）反应中不可少的辅酶，这类物质一般是小的有机化合物，和辅基不同点是与酶蛋白结合很松弛，用透析和其它方法很易将它们与酶分开，尽管它们不用于酶的底物，特异性不强，往往参加一系列酶反应和代谢过程。但在作用方式上和底物类似，在酶反应过程中与酶结合、分离及反复循环。在方法学上，可将它们按底物处理，即可按米-门方程式求出其Km，按底物规律选择其浓度。

　　第二是辅基，辅基虽也是小的有机化合物，但却是酶蛋白不可分割部分，不含辅基的酶蛋白称为脱辅基酶蛋白（apoenzyme），没有催化活性，必须加入足量辅基，和它结合成为全酶（holoenzyme），才可能有催化活性。最典型的例子是各种转氨酶需要磷酸吡哆醛为其辅基，在反应过程中。氨基酸将其氨基交给吡哆醛变为吡哆胺，本身接受醛基成为酮酸，然后吡哆胺将氨基转交给酮酸生成氨基酸，本身又变回吡哆醛。从此机制不难理解为何脱辅基酶蛋白无催化活性。

　　辅基和辅酶不同点不仅表现在和酶蛋白结合紧密，不易为透析所除去，和酶作用方式也不同，不似辅酶迅速与酶结合，又迅速分解为酶和产物，辅基显著特点之一是与酶结合需要一定时间，因此在酶测定时，如按底物一样来处理辅基，在酶反应开始时才加入辅基，则开始阶段反应较慢，经过一段延滞期后，反应才达到应有速度。因此在酶测定时，往往是先加入足量辅基，作用一定时间如10分钟后，再加入底物开始酶反应。

　　很多辅酶和辅基来自维生素或结构中含有维生素，如NAD和NADP来自维生素尼克酸，转氨酶的辅基磷酸吡哆醛来自维生素B₆（吡哆醇）。来自维生素B₁的焦磷酸硫胺素是丙酮酸脱羧反应的辅羧化酶。从维生素B₂（核黄素）形成的FAD，FMN是很多呼吸链上酶的辅基，维生素H（生物素）在羧化和脱羧作用中起辅基作用，叶酸衍生物参与一碳基团的转移。维生素B₁₂的衍生物钴胺酰胺参与酶催化的异构反应。

　　第三类物质是离子，很多酶需要特定离子帮助才能使其反应达到最大速度。最常见的是二价金属离子如Mg²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Fe²⁺等。所有转移磷酸的酶，如激酶类和碱性磷酸酶的反应都需要Mg²⁺的参加。所以如在反应体系中加入金属螯合剂如ED-TA或以他们为抗凝剂常抑制一些酶的活性。因此酶测定的标本多采用血清而不采用血浆，以外还有单价的K⁺。如丙酮酸激酶反应同时需要K⁺和Mg²⁺。淀粉酶催化的反应需要阴离子Cl^-，5mmol/L氯离子可加速淀粉酶的反应三倍。

　　离子加速酶反应的机制是多种多样，Zn²⁺是碱性磷酸酶和羧基肽酶A整体结构的一部分，可稳定酶的三级和四级结构。Cl^-加速淀粉酶反应的机制可能与它能与酶分子中某些带阳电荷基团结合有关，改变了在催化作用中起重要作用的基团的电离常数，有些离子可使酶分子带阳电荷，和带阴性电荷的底物结合，在酶反应中起了桥梁作用。必须注意的是，过量的离子往往抑制酶反应速度，在测定酶时要选择合适的浓度。

　　第四类是一些无法包括在前三类的其它加速酶反应物质，如巯基化合物可稳定酶的双硫键。在肌酸激酶反应体系中加入它将明显增高酶活性，并且随所加巯基化合物的不同，增加的速度也有差异，所以在测肌酸激酶时要选择好巯基化合物的种类与合适的浓度。

　　还有所谓的表观激活作用，该物质并不是真正加快反应速度，而是由于和抑制剂作用抵消了抑制作用，从表面上看似乎是加速了酶的反应作用。

　　（三）选变构剂的种类与浓度

　　有一类特殊的酶叫变构酶（allosteric enzyme），其反应速度和底物关系不同于一般酶的双曲线，而出现S形曲线，这是由于这种酶具有二个或更多个独特的部位－或是相互作用的催化部位，或是相互作用的催化部位与调节部位，其结果是酶与底物作用速度将受另一类物质的影响，这类物质命名为变构剂或效应物。根据作用不同又分为变构激活剂和变构抑制剂或者正负效应物，而不同浓度的变构剂会明显改变曲线形状。变构酶在物质代谢中有重要的调节作用。在测定变构酶活性浓度时，必须选择好变构剂种类和浓度。一般来说应选择在饱和浓度的变构剂的条件下测定构酶的活性浓度。

　　二、指示酶与辅助酶的种类和浓度

　　采用酶偶联法测定酶活性浓度时，反应体系必须加入指示酶，有些方法还加用辅助酶，在选择或设计此类方法时，必须考虑合适的酶和浓度，有关问题将在后面“连续监测法酶活性浓度”一节中详加讨论。

　　三、反应体系的最适pH、缓冲液的种类和浓度

　　固定酶反应的其它条件，在不同pH处测定酶反应速度，可得各种类型的酶活性与pH关系见图17-3A。

图17-3A　酶活性与pH的函数关系曲线可能具有的几种形状

　　最常见的是（a）的对称钟形曲线，少数的如（b）（c）在一侧即偏酸或偏碱处活性最高。生化学家将酶活性最高处的pH称为最适pH。一般来说，血清中大多数酶最适pH接近中性（pH6.5-7.5）。有些酶在最适pH处活性变化尖锐明显，也有些平坦宽广。测定酶活性浓度时一定要选择在最适pH处，不仅因为此处酶反应速度最大，测定灵敏度最高，还因为此处酶活性变化的斜率最小，如反应体系中出现pH变化时，对测定结果影响最小。

图17-3B　pH对酶活性及稳定性的作用

　　曲线A：V对pH作图曲线B：酶先在pH5及pH8预孵育后，在pH6.8测活性

　　氢离子可以通过多种途径影响酶催化反应。如在脱氢酶反应中往往需要氢离子参加，也可能产生氢离子，从理论上可以将氢离子看成是该反应的底物和产物之一。此外，当pH变化时，可影响到底物、酶、酶-底物复合物的解离状态和构型，甚至还可能影响到各种辅因子，从而影响酶活性。

　　PH对酶还有一个重要的作用，就是影响酶的稳定性。图17-3B介绍一个有关实验。

　　图中曲线A是最适pH实验的结果，出现典型的钟形曲线，其最适pH为6.8，高于或低于6.8时，酶反应速度下降，下降原因可能与上述诸因素有关，但也可能由于酶稳定性下降失活所致，或者是二类原因之总和。通过曲线B的实验，可将上述二类原因分清。此时先将酶与不同pH底物缓冲液温育一段时间，此时间一般与测定时间相当，然后再将pH调回最适pH处测其活性。从曲线B可以说在pH5-6.8以及pH6.8-8.0之间酶活性的下降与酶灭活关系不大，酶在最适pH处储存常数稳定。但有些酶贮存在最适pH时，并不一定比在其它pH处更稳定。

　　最适pH并非是酶的特征性常数，易受多种因素影响而改变，如缓冲液的种类、底物浓度、温度等，在研究pH对酶稳定性影响还应注意到酶浓度高低，在低浓度时，酶易解离为单体，常比多聚体更易灭活。还应注意试剂中各种防腐剂和其它添加剂的影响。

　　最后必须强调的是本节讨论的pH并不是指底物缓冲液的pH，而是底物和标本混合后的pH对反应速度的影响，由于实验室所测的标本很少是纯酶样品，多为体液或组织粗提液。它们也是有一定pH值和缓冲能力的缓冲液，和底物缓冲液混后后，不一定维持住原来pH，特别是当二溶液的pH相差甚远时，变化更大。例如碱性磷酸酶最适pH为10.2，虽然底物pH也是10.2，但血清标本pH为中性，混合液的pH必然低于10.2，降低程度取决于血清的pH和缓冲能力。从而影响酶测定结果，临床观察证实：当血清标本放置过夜后用金氏法再测碱性磷酸酶时，结果常升高。有人认为这与血清放置过长，由于CO₂逸出引起血清pH偏碱有关。

　　在下列情况极易引起混合液pH偏离底物缓冲液的pH：一是标本用量太大，如以前有些方法，为节省底物，底物缓冲液用量和血清用量相等，此时混合液pH可能在此二液pH之间，有可能引起较大测定误差。所以在文件中规定“标本在总体积中的比例应在10％以下”。就是要尽量减少标本中各种物质对测定结果的影响。二是底物缓冲液缓冲能力太低。如金氏法测碱性磷酸酶时使用的碳酸盐缓冲液的浓度为0.01mol/L，浓度这样低的缓冲液，必定要受标本pH的影响。

　　过去长期以来，认为缓冲液作用就是维持酶反应的最适pH，忽视了缓冲物质对酶反应的其它作用和影响，Howell等研究了酶活性在三种不同缓冲液的变化情况见图17-4。

图17-4　各种缓冲液的温度及pH的关系
TRIS：三羟甲基氨基甲烷0.1mol/L
TRA：三乙醇胺0.1mol/L

　　三种不同缓冲液不仅最适pH不一样，最大反应速度也有差异，从测定酶活性浓度角度，应该选用枸橼酸缓冲液，类似现象在大多数酶都能观察到，仅是程度不同，其中以碱性磷酸酶活性受到缓冲液种类影响最为显著，在二乙醇胺缓冲液所测酶活性约比在碳酸盐缓冲液所测的高2倍。

　　由于缓冲液含有大量离子，或影响酶蛋白的构型，或影响底物的解离程度等等，从而影响酶活性。Allert曾拟定了一种作用模式，并进行数学计算，得出相应方程式来说明反应体系中电解质会影响最大反应速度V，且不同浓度电解质的影响有差异。因此在方法设计时，选完缓冲物质后，还必须了解不同浓度缓冲液对酶活性的影响。一般而言，随缓冲液浓度增加，电解质干扰酶和底物结合，酶活性将逐步下降，所以选择缓冲液浓度时，常需在浓度较高以保持足够缓冲能力和浓度较低以免抑制酶活性两个相矛盾作用之间取得平衡。

　　在目前酶测定常用的一大类所谓生物缓冲物质，如图中的Tris、三乙醇胺受温度影响较大。因此在我国学会文件中指出“配制缓冲液时不仅要指出其pH值，还应说明配制温度，以避免因温度不同而引起的误差。”在此图中还可看到，即使是同一种缓冲液，随其它物质存在，也有可能改变温度的影响。因此在实际配制缓冲液时，应首先将配制溶液温度调节到规定温度，然后在pH计监测下加入相应的酸或碱将溶液pH调到要求范围。不控制温度，不用pH计盲目按一些书提供的量配制缓冲液是不可取的。

　　四、其它影响酶活性因素

　　除了上述主要因素外，一些其它因素也会影响酶活性，如反应体系中含有氧化剂，可氧化酶蛋白中甲硫氨酸、色氨酸和酪氨酸残基，使酶失活，试剂盒中常用的一些表面活性剂如Tween-80、Brig-35等会抑制一些酶的活性。

　　其它因素中，对酶测定而言，最重要的是抑制剂的作用，抑制作用是酶学中的一个重要研究内容。但如只涉及到设计和选择测定酶的方法，则比较简单，既然要测定的是“最适条件”下的最大反应速度，那么不论是可逆或不可逆抑制剂，也不论是竞争性、非竞争性、反竞争性抑制剂都应在反应体系中设法除去。此问题在测定尿液中尤为突出。尿中排出大量代谢产物，不少物质会影响酶，如脲可使酶解聚、磷酸盐抑制磷酸酶活性。在病理情况下尤其使用各种药物后，使情况更为复杂，此时尿中可出现不少正常情况下不出现物质，即可能抑制酶活性，也可能激活酶活性。为使脲酶测定结果有一定可比性，最好在测定脲酶前，通过透析、凝胶层析或超滤将小分子化合物与酶分开，这样较为可靠。

　　五、温度的控制

　　要了解此问题，应注意温度对酶活性影响的双重性。首先，化学速度随温度升高而加快，酶反应也不例外。Q₁₀值即温度增加10℃，化学速度的变化率。酶的Q₁₀值约在1.5-2.5之间。

　　温度与反应速度之间关系，可用Arrhenius方程式来表示：

　　Logk＝－E/2.303RT+常数

　　式中k是反应常数，T为绝对温度，R为气体常数。E为活化能也是常数。在酶反应中V＝K·[E]。所以在酶反应中，LogV和1/T作图为一直线，斜率为－E/2.303R。通过每一直线斜率不难计算出该酶反应的活化能E。

　　但是，测定酶时都需要酶和底物在一定温度下作用一段时间，在此期间，温度有可能使酶失活，不同酶在此方面差异很大，有些酶如胎盘碱性磷酸酶在56℃放置15分钟，活性也不下降，有些酶如酸性磷酸酶，37℃1小时后，失去50％酶活性。酶的稳定性还与其它因素，如作用时间、pH、有无底物、有无其它蛋白等有关。同为碱性磷酸酶，在肝提取液中远不如血清中稳定，37℃作用15分钟后肝中此酶活性将显著下降。又如将血清pH降低在pH6.0以下，血清中酸性磷酸酶将长期稳定。

图17-5　预温15分（37℃，pH9.9）对ALP活性的影响
○与●表示肝ALP活性不预温和预温的变化
△与▲表示血清ALP活性不预温和预温的变化

图17-5形象说明预温过程对酶活性的影响。

　　目前常规工作实验室越来越多的使用37℃，一些国家已明确推荐使用此温度。这更多地是从实际工作方便来考虑。因为温度升高，反应速度快，灵敏度高。同时延滞时间和测定时间都可能缩短。从而有利于提高工作效率。尤其目前在常规实验室中广泛使用全自动生化分析仪，有高效率的恒温系统，使反应系统很快升温并维持在37℃，可避免温度差异引起的误差。但在37℃时，不可避免地一些酶可能失活。

　　早期曾推荐使用25℃为酶测定温度，其优点为接近室温，反应体系温度很容易平衡到此温度，这对于当时使用无有效控温系统的分光光度计来测酶活化性有其特别方便之处。但温度低。反应太慢。在有些温热地区，当室温超过25℃时，还需使用降温系统很不方便。因此目前已很少有实验室采用此温度。

　　IFCC推荐的30℃，兼顾了上述二温度的优点，即保证了一定的反应速度。又无酶失活之扰，此外还有一个上述二温度没有的优点，即可以镓作为此温度的基准物质，纯镓的熔点为29.77℃。保证了测定系统计30℃的高度准确性，而37℃和25℃至今尚无一个最准确的确定方法。

　　30℃和37℃是目前使用最广泛的二种测定酶的使用的温度。在比较不同实验室测定结果时，一定要注意由此引起来的差异，否则将导致临床诊断的困难和误差。一些作者提出使用二温度间的转换系数使二温度测定结果的比较变为可比。虽然一些作者持怀疑态度，用一个系数能代表所有标本中的变化情况吗？最新研究证实只要所用方法合适，人类血清中酶对温度变化的反应差异不大，在无法统一温度情况下，这还不失为一权宜之计，常用酶的温度转换系数可参见表17-4：

表17-4　常见酶温度转化系数

　　不论选用何种温度测酶，由于酶反应受温度影响很大，在测定时间内，反应体系的温度变化应控制在±0.1℃内。应用国产普通恒温水浴箱来测酶活性是不合适的，应使用带有搅拌器的高级恒温水浴。