第二节自身抗体的检测及临床意义

第二节　自身抗体的检测及临床意义

　　多数自身免疫病血清中都会出现自身抗体。虽然有些自身抗体在疾病中的确切意义尚未得到严格的证实，但其与疾病的相关性已得到认可，所以些自身抗体在自身免疫病的诊断和疗效评价方面都具有重要的意义。

　　一、抗核抗体

　　抗核抗体（antinuclearantibodies，ANA）泛指抗各种核成分的抗体，是广泛存在的自身抗体。ANA的性质主要是IgG，也有IgM和IgA，甚至IgD和IgE。ANA可以与不同来源的细胞核起反应，无器官特异性和种属特异性。ANA主要存在于血清中，也可存在于其他体液如滑膜液、胸水和尿液中。

　　ANA在SIE患者的滴度较高，但也出现在其他许多自身免疫病中，在许多研究报告中，都将检出ANA作为自身免疫甚至自身免疫病存在的依据。这种现象的机制尚未明了，有待于进一步研究。

　　（一）ANA的类型及意义

　　由于细胞核成分的复杂性，不同成分的抗原性也不同；因此就会有多种不同的ANA。

　　1．抗核蛋白抗体核蛋白抗原（DNP）由DNA和组蛋白组成。由于DNP抗原存在不溶性和可溶性两个部分，可分别产生相应的抗体。不溶性DNP抗体通常不完全被DNA和组蛋白所吸收，它是形成狼疮细胞的因子；可溶性抗原存在于各种关节炎病人的滑膜液中，其相应抗体也出现于RA病人的滑膜液中。

　　2．抗DNA抗体可以分为两大类：①抗天然DNA（nDNA）抗体，或称抗双链DNA（dsDNA）抗体；②抗变性DNA抗体，或称抗单链DNA（ssDNA）抗体。抗dsDNA抗体对SLE有较高的特异性，70％～90％的活动期SLE病人该抗体阳性，效价较高，并与病情有关。抗ssDNA抗体可见于多种疾病中，特异性较差。

　　3．抗ENA抗体可提取性核抗原（ENA）多从动物的胸腺中提取。先将胸腺匀浆并破碎细胞，分离出细胞核；再经盐水或磷酸盐缓冲液处理后，很容易从胞核中提取出来。ENA不含DNA，对核糖核酸酶敏感。近年来的研究表明，ENA可分为十几种，现仅介绍几种主要的ENA及其相应抗体。

　　（1）抗PNP抗体：PNA即核糖核蛋白，对核糖核酸酶和胰蛋白酶敏感，加热561h变性。抗PNP抗体多见于混合性结缔组织病。高效价的抗PNP抗体对混合性结缔组织病有诊断意义，而低效价的抗PNP抗体可在SIE患者中发现。

　　（2）抗Sm抗体：该抗体在一名Smith姓的患者血中首次发现，便以其名字的前两个字母命名。Sm抗原系非核酸性糖蛋白，对DNase及RNase均不敏感，但经碘酸盐及胰蛋白酶处理后可被水解。抗Sm抗体是SLE的特异性标志之一，但阳性率偏低，约为30％～4％；可能是SIE的一种回忆性抗体，故在非活动期亦可检出。若将抗dsDNA和抗Sm抗体同时检测，可提高SLE的诊断率。

　　（3）抗SS-A抗体：SS-A为干燥综合征（SS）的A抗原，可从动物胸腺的胞浆中提取。抗SS-A抗体主要见于SS，但也可见于其他自身免疫病如SLE中。

　　（4）抗SS-B抗体：SS-B为SS的B抗原，亦可从动物胸腺或小鼠肝细胞浆中提取，可被胰蛋白酶、轻度加热或改变溶液pH而破坏。13％的SLE及30％的SS患者有抗SS-B抗体。

　　（5）抗组蛋白抗体（AHA）：组蛋白是一种碱性蛋白质，含有大量的赖氨酸及精氨酸。已经发现组蛋白抗原可分为5个亚单位：H-1、H2A、H-2B、H-3、H-4。抗组蛋白抗体及其抗亚单位抗体见于SLE及药物诱发的LE。SLE病人血清中的抗组蛋白亚单位抗体检出率顺序为：抗H-2B、抗H-1、抗H-3、抗H-2A及抗H-4，以抗H-2B和抗H-1为主，并与SLE的活动性有关。

　　（二）ANA的检测方法

　　由于ANA的复杂性及多样性，故测定方法繁多。目前ANA常用的方法有免疫荧光法、放射免疫法、ELISA、免疫双扩散、对流免疫电泳及免疫印迹技术等。

　　1．免疫荧光法检测血清总ANA最常用的方法是荧光免疫组化法。多用小鼠肝切片或印片作为细胞核基质，结果比较稳定可靠，在荧光显微镜下见到的细胞核有荧光着色为阳性反应。如将患者血清先进行不同比例的稀释，可以做大致的定量试验，在1:80稀释仍然虽阳性时，对SLE的诊断有较大的参考价值。在油镜下观察结果，可以将ANA阳性的荧光现象分成4种主要的荧光核型，核型的确定对临床诊断有进一步的参考价值。①周边型表示抗DNA抗体存在；②均质型表示有抗DNP抗体；③斑点（颗粒）型多为抗ENA抗体；④核仁型多为抗核小体抗体。SLE患者常出现周边型、匀质型或混合型，斑点型多见于混合结缔组织病，而硬皮病多为核仁型；周边型对SLE有较高的特异性。

　　近年有人用锥虫或血鞭毛虫（例如绿蝇短膜虫试验）作基质测定抗dsDNA抗体，因为这些血寄生虫的动基体内含大量的纯dsNDA，无其他抗原干扰；在阳性结果时，可见鞭毛一端的动基体显示清晰的荧光。因此该试验用于测定抗dsDNA抗体具有特异性强和敏感性高的优点。另外，短膜虫对人畜无害，可以人工养殖，来源方便，值得推广。

　　2．放射免疫法常用检测抗DNA抗体，有Farr法及过滤法。①Farr法的原理为用同位素标记DNA，被标记的DNA和被检血清的抗DNA抗体结合，经50％硫酸铵饱和液沉淀，然后比较沉淀物和上清液中的放射活性，从而得出DNA结合活性，一般结合率大于20％为阳性。②过滤法是在分离结合物时用纤维素酯薄膜滤器（孔径为0.45μm）进行过滤，游离的DNA被滤去而与抗体结合的复合物被阻留在滤膜上。

　　3．ELISA临床上主要是应用间接ELISA检测抗dsDNA抗体，其重复性及敏感性均较对流免疫电泳及双扩散为高。目前已有试剂盒供应。

　　4．免疫印迹（immunoblotting）先将混合抗原作凝胶电泳，分离开不同的区带，然后将这些带转印到硝酸纤维素膜上，最后用酸标抗体或放射性同位素标记抗体进行检测和分析（方法见第十五章）。由于该试验不需纯化的单个抗原，可在同一固相上作多项分析检测，灵敏度高，特异性强。故目前已广泛用于自身免疫病患者血清中多种自身抗体的检测，如检测抗Sm抗体、抗RNP抗体、抗SS-A抗体及SS-B抗体等。

　　另外，还可用传统的琼脂双向扩散法、对流免疫电泳法、间接血凝法和补体结合试验等。这些试验要求的实验条件比较低，但敏感性也比较低。

　　二、类风湿因子

　　类风湿因子（RF）是抗变性IgG的自身抗体，主要为19S的IgM，也可见7S的IgG及IgA。它能与人或动物的变性IgG结合，而不与正常IgG发生凝集反应。RF主要出现在类风湿性关节炎患者，约70％～90％的血清中和约60％的滑漠液中可检出IgG类RF，这很可能是自身IgG变性所引起的一种自身免疫应答的表现。

　　IgG是感染等原因诱导的免疫应答中的主干抗体，这些抗体与相应抗原结合时会发生变性；此外，在炎症等病理条件下滑漠或其他部位可能产生不正常的IgG；这些变性IgG就构成自身抗原，刺激免疫系统产生各种抗IgG抗体。滑膜液中的IgG类RF与变性IgG结合而形成中等大小的免疫复合物，比血清中的IgM类RF更具有致病意义，因为这一类免疫复合物易于沉积在关节滑膜等部位，可激活补体，形成慢性渐进性免疫炎症性损伤。

　　RF的检测最初是用致敏绵羊红细胞凝集试验（Rose-Waaler法）进行检测，目前最常采用IgG吸附的胶乳颗粒凝集试验；但此法的灵敏度和特异性均不高，而且只能检出血清中的IgM类RF。IgG类和IgA类RF则需要用RIA或ELISA等方法检测。

　　RF在类风湿性关节炎患者中的检出率很高，RF阳性支持早期RA的倾向性诊断，如对年轻女性应进行RA和风湿热间的鉴别；而对非活动期RA的诊断，需参考病史。但RF也象ANA一样，并不是RA独有的特异性抗体。在SLE病人均有50％RF阳性，在其他结缔组织病如SS、硬皮病、慢性活动性肝炎及老年人中均可有不同程度的阳性率。

　　三、其他自身抗体

　　（一）抗甲状腺球蛋白及微粒体抗体

　　这类抗体可以针对甲状腺的多种成分，以甲状腺球蛋白和微粒体为代表。抗体主要是IgG，可以介导ADCC活性，引起慢性淋巴细胞性甲状腺炎，又称乔本（Hashimoto）甲状腺炎。

　　检测方法多用免疫荧光技术，以甲状腺组织的冰冻切片作基质。也可用RIA、ESISA等方法进行检查。强阳性反应或高滴度抗体对乔本甲状腺炎和原发性甲状腺功能减退症有诊断意义，抗体变化对于疾病治疗转归的评价甚为重要，对乔本甲状腺炎与甲状腺功能亢进的鉴别诊断也有较大价值。正常人血清中很少检出甲状腺抗体，或仅有5％～10％无疾病症状人群有低度反应；女性和年龄较大的人群检出率较高。检出该抗体可提示既往患过自身病，也可能是自身免疫病的早期指标。

　　在甲状腺功能亢进(Graves病)患者的血清中存在甲状腺刺激抗体(TSAb)，包括长效甲状腺刺激素(LATS)和LATS者(LATS-P)。这些抗体作用于甲状腺细胞表面的TSH受体，使受体活化并促进甲状腺素的释放；过多的甲状腺素引起机体的代谢亢进。

　　（二）抗乙酰胆碱受体抗体

　　抗乙酰胆碱受体（AchR）抗体可结合到横纹肌细胞的乙酰胆碱受体上，引起运动终板的破坏，使神经－肌肉之间的信号传导发生障碍，导致骨髓肌运动无力，称为重症肌无力（myastherniagravis，MG）。疾病可发于任何年龄，最先出现的症状常是眼肌无力，进而累及其他部位，常呈进行性加重。

　　抗AchR抗体多用较敏感的方法进行检测。①ELISA法：以α-银环蛇毒素包被酶标板，并与骨骼肌匀浆（含AchR）作用，再加入待测血清和对照血清，最后加酶标抗体。试验的正常结果为阴性或≤0.03mmol/L。②放免法：将放射性同位素标记的α-银环蛇毒素与骨骼匀浆结合，再加入患者血清和抗人IgG使之沉淀，检测沉淀物的放射性。

　　抗AchR抗体的检测对MG具有诊断意义，且特异性和敏感性较高，大约90％的MG患者阳性；伴有眼肌症状的病人，抗体效价低于普通症状的病人；同时还用来监测对该疾病免疫抑制治疗的效果。肌萎缩侧索硬化症患者用蛇毒治疗后可出现假阳性。

　　（三）抗平滑肌抗体

　　抗平滑肌抗体（ASMA）产生机制不明，但与肝和胆管的自身免疫疾病有关，尤其是慢性活动性肝炎（狼疮性肝炎）和原发性胆汁性肝硬化（PBC）。该类疾病的发生与自身免疫性密切相关，试验结果有助于诊断以及与其他肝病的鉴别诊断。

　　ASMA的检测用间接免疫荧光法，用大鼠胃大弯或小弯的冰冻切片作基质；正常结果为阴性或≤1:20。检出阳性率较高的疾病有慢性活动性肝炎和PBC；而在肝外性胆汁阻塞、药物诱发性肝病、急性病毒性肝炎及肝细胞癌等时ASMA的检出率极低。

　　（四）抗心肌抗体

　　在心肌受损（例如手术、感染或梗塞等）时，心肌细胞内的物质释出，作为隐蔽抗原刺激机体产生抗体。这些抗体与心脏结合可导致新的免疫性损伤，例如心包切开综合征、风湿性心脏病等。

　　抗心肌抗体的检测用胎儿或大鼠心肌的冰冻切片作抗原基质，进行免疫荧光检测，正常值为阴性。阳性结果相关的疾病有：心脏术后综合征、心肌梗塞后综合征和风湿性心脏病等。

　　（五）抗线粒体抗体（AMA）检测

　　抗线粒体抗体（AMA）所针对的抗原是内层线粒体膜，无器官特异性和种属特异性。该抗体主要是IgG，与PBC相关，但对肝细胞或胆管没有直接的损伤效应，在疾病中的作用尚不明确。

　　AMA用免疫荧光法进行检测，用大鼠肾的冰冻切片作基质；也可用补体结合试验来检测。正常结果为阴性或效价在1:5以下。PBC患者可有79％～94％为阳性反应或效价≥1:160；长期持续性肝阻塞、慢性活动性肝炎；、原因不明性肝硬化等也可呈阳性反应。但是肝外性黄疸为阴性。

　　（六）抗胃壁细胞抗体

　　抗胃壁细胞抗体（APA）可以破坏胃粘膜的壁细胞，使内因子产生障碍，有时也可发现抗内因子抗体而使其功能受阻，从而导致恶性贫血的发生。患者可无前驱症状或患有胃炎。

　　APA常以间接免疫荧光法检测，用人或家兔的胃冰冻切片作抗原基质，正常成人为阴性反应，正常儿童可有2％～20％的检出率。恶性贫血患者能检出抗胃壁细胞或抗内因子抗体。而其他各种贫血患者不能检出其中任何一种抗体。胃溃疡或胃癌等极少该抗体阳性。

　　（七）抗胰岛素抗体

　　抗胰岛素抗体在体内可与胰岛素结合形成抗原抗体复合物，使胰岛素的活性明显降低甚至无效；从而导致胰岛素依赖性糖尿病，必需注入大量胰岛素才能有疗效。该抗体主要为IgG，其他4类Ig也存在；其中IgE类抗体可引起病人的变应性反应，IgM类可能引起胰岛素耐受。

　　检测抗胰岛素抗体及其免疫球蛋白类别可用各种琼脂扩散试验、间接血凝和ELISA等方法，试验结果会有助于糖尿病的分型诊断及适当治疗。此外，还可用于监测病人的胰岛素耐量。

　　（八）抗肾小球基底膜抗体

　　抗肾小球基底膜（GBM）抗体多产生在链球菌感染后，为共同抗原交叉诱导产生。抗GBM抗体可引起GBM损伤，导致肾小球肾炎的发生。

　　抗GBM抗体的检测也是用荧光或酶免疫组化法，用动物或人的肾组织冰冻切片作抗原基质。阳性反应可见与肾小球血管走行相一致的荧光染色或酶底物染色；这与免疫复合物时斑块状分布的染色现象完全不同。试验正常值为阴性。该试验主要用于肾小球肾炎的分型诊断与鉴别诊断。约5％的肾小球肾炎由抗GBM抗体引发，为自身免疫性。

　　（九）抗精子抗体

　　正常情况下精细胞是隐蔽抗原，但当外伤、手术或感染时，精子可与免疫系统接触，诱导机体产生抗精子抗体。高滴度的抗精子抗体可使精细胞的活力下降甚至数量减少，是导致男子不育症的原因之一。在部分女性也可检出抗精子抗体，可能与不孕症相关。

　　抗精子抗体的检测方法很多，例如精子制动试验、精子凝集试验、免疫荧光法、ELISA法和免疫珠结合法等。抗精子抗体阳性相关的疾病有实验性输精管阻塞和输精管切断等，一部分妇女和孕妇也可检出抗精子抗体。

　　（十）抗血细胞抗体

　　抗红细胞抗体主要涉及ABO的Rh血型抗体及自身免疫性抗体，与输血、新生儿溶血症和自身免疫性溶血性贫血等相关。抗血小板和抗白细胞抗体等均与自身免疫性血液病相关（详见血液学检验教材）。