第二节金免疫测定

第二节　金免疫测定

　　在第十五章酶免疫测定中已叙述了斑点-ELISA和RIBA两种斑点免疫结合试验，本节介绍的两种方法（斑点金免疫渗滤试验和斑点免疫层析试验）是在以上两种方法的基础上发展形成的，均以硝酸纤维素膜为固相载体，以免疫金为结合物。因其最大特点是简便快速，故统称为快速斑点免疫结合试验。

　　一、斑点金免疫渗滤试验

　　斑点免疫渗滤试验的基本原理是：以硝酸纤维素膜为载体，利用微孔滤膜的可滤过性，使抗原抗体反应和洗涤在一特殊的渗滤装置上以液体渗滤过膜的方式迅速完成。斑点免疫渗滤试验最初是从斑点ELISA基础上发展起来建立的，应用的结合物是酶标记的，称为斑点酶免疫渗滤试验。90年代初发展了以胶体金为标记物的斑点免疫渗滤试验（dotymmunogoldfiltrationassay，DIGFA），又名滴金免疫测定法（简称滴金法）。在滴金法中不需酶对底物的反应，更加简便、快速，在临床检验中应用日渐广泛。

　　（一）原理

　　以双抗体夹心法为例。在硝酸纤维素膜的膜片中央滴加纯化的抗体，为膜所吸附。当滴加在膜上的标本液体渗滤过膜时，标本中含抗原被膜上抗体捕获，其余无关蛋白等没滤出膜片。其后加入的胶体金标记也在渗滤中与已结合在膜上的抗原相结合。因胶体金本身呈红色，阳性反应即在膜中央显示红色斑点。

　　（二）试剂和操作

　　1．渗滤装置渗滤装置是滴金法测定中的主要试剂成分之一，由塑料小盒、吸水垫料和点加了抗原或抗体的硝酸纤维素膜片三部分组成。塑料小盒可以是多种形状的，盒盖的中央有一直径约0.4～0.8cm的小圆孔，盒内垫放吸水垫料，硝酸纤维素膜片安放在正对盒盖的中央有一直径约0.40.8cm的小圆孔，盒的垫放吸水塑料，硝酸纤维素膜片安放在正对盒的圆孔下，紧密关闭盒盖，使硝酸纤维素膜片贴紧吸水垫料。如此即制备成一渗滤装置（图19-1）。塑料小盒的形状最多见的是扁平的长方形小板，加之滴金法的整个反应过程都是在渗滤装置上进行的，因此又常称渗滤装置为滴金法反应板。

　　2．试剂盒组成滴金法试剂盒的三个基本试剂成分是滴金法反应板、免疫金复合和洗涤液。为了提供质控保证，用于抗原测定的试剂盒还应包括抗原参照品，相应的检测抗体的试剂盒应有阳性对照品。

　　3．测定操作以双抗体夹心法为例，具体步骤如下：

　　（1）将反应板平放于实验台上，于小孔内滴加血清标本1～2滴，待完全渗入。

　　（2）于小孔内滴加免疫金复合物试剂1～2滴，待完全渗入。

　　（3）于小孔内滴加洗涤液2～3滴，待完全渗入。

　　（4）判读结果：在膜中央有清晰的淡红色斑点显示者判为阳性反应；反之，则为阴性反应。斑点呈色的深浅相应地提示阳性强度。

　　（三）质量控制

　　滴金法的质量控制常采用在硝酸纤维素膜上点加质控点的方法。质控小圆点多位于反应斑点的正下方。双抗体夹心法的质控点最好是相应抗原，若该抗原试剂不易制备或价格昂贵时，也可用SPA或针对金标抗体的抗抗体来充当。间接法的质控点采用盐析法粗提的人IgG最为经济、方便。

图19-1 DIGFA渗滤装置及操作示意图

A：操作示意图B:装置分解图

　　有将包被斑点由圆点改成短线条式的：质控斑点横向包被成横线条，如“－”；反应斑点纵向包被成竖线条，如“∣”；两者相交成“＋”。样，阳性反应结果在膜上显示红色的正号（＋），阴性反应结果则为负号（－），目视判断直观、明了。

　　二、斑点免疫层析试验

　　（一）原理

　　斑点免疫层析试验（dotimmunochromatographicassay，DICA）简称免疫层析试验（ICA），也以硝酸纤维素膜为载体，但利用了微孔膜的毛细血管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移，犹如层析一般。

　　（二）试剂和操作

　　免疫层析试验以单克隆双抗体夹心法为例。试验所用试剂全部为干试剂，多个试剂被组合在一个约6mm×70mm的塑料板条上，成为一单一试剂条（图19-2），试剂条上端（A）和下端（B）分别粘贴吸水材料，免疫金复合物干片粘贴在近下端（C）处，紧贴其上为硝酸纤维素膜条。硝酸纤维素膜条上有两个反应区域，测试区（T）包被有特异抗体，参照区（R）包被有抗小鼠IgG。

图19-2 免疫层析试验原理示意图

　　测定时将试纸条下端浸入液体标本中，下端吸水材料即吸取液体向上端移动，流经C处时使干片上的免疫金复合物复溶，并带动其向膜条渗移。若标本中有待测特异抗原，其时可与免疫金复合物之抗体结合，此抗原抗体复合物流至测试区即被固相抗体所获，在膜上显出红色反应线条（T）。过剩的免疫金复合物继续前行，至参照区与固相小鼠IgG结合（免疫金复合物中的单克隆抗体为小鼠IgG），而显出红色质控线条（R）。反之，阴性标本则无反应线条，而仅显示质控线条。

　　斑点免疫层析试验在试剂形式和操作步骤上较前述的几种免疫测定法都更为简化，只用一个试剂，只有一步操作。

　　三、应用

　　上述两种试验的共同特点是：简便、快速、单份测定、可立等结果，除试剂外无需任何仪器设备，且试剂稳定。因此特别适用于急诊检验。但这类试验不能准确定量，所以主要限于检测正常体液中不存在的物质（例如诊断传染病中的抗原或抗体）以及正常含量极低而在特殊情况下异常升高的物质（如HCG等）。临床检验中已开展的项目有HCG、抗HCV和抗HIV等。新项目正在不断发展中。