生物芯片的制作

发布：www.liulingling.com　来源：医学杂志

生物芯片的制作

　　对于一些实验室来说，如果现成的商品化芯片不能满足研究需要，而自行设计向厂家定做芯片也不能满足时间的需要时，就需要自制芯片。要成功的制作芯片，需要准备3大材料：准备固定在芯片上的生物分子样品、芯片片基和的制作芯片的仪器。研究目的不同，期望制作的芯片类型不同，制备芯片方法也不尽相同，以DNA芯片为例，基本上可分为两大类：一类是原位合成（即在支持物表面原位合成寡核苷酸探针），适用于寡核苷酸；一类是预合成后直接点样多用于大片段DNA，有时也用于寡核苷酸，甚至mRNA。

　　原位合成有两种途径，一是原位光刻合成（Affymerix公司专利技术，参见前文介绍），该方法的主要优点是可以用很少的步骤合成极其大量的探针阵列。某一含N个核苷酸的寡聚核苷酸，通过4×N个化学步骤能合成出4N个可能结构。例如合成想要8核苷酸探针，通过32个化学步骤，8个小时可合成65，536个探针。而如果用传统方法合成然后点样，那么工作量的巨大将是不可思议的。同时，用该方法合成的探针阵列密度可高达到106/cm2。

　　另原位合成是压电打印法(Piezoelectric printing)。原理与普通的彩色喷墨打印机相似，所用技术也是常规的固相合成方法。不过芯片喷印头和墨盒有多个，墨盒中装的是四种碱基合成试剂。喷印头可在整个芯片上移动。支持物经过包被后，根据芯片上不同位点探针的序列需要将特定的碱基喷印在芯片上特定位置。冲洗、去保护、偶联等则同于一般的固相合成技术。该技术采用的化学原理与传统的DNA固相合成一致，因此不需要特殊制定备的化学试剂。每步产率可达到99%以上，可以合成出长度为40到50个碱基的探针。

　　尽管如此，原位合成方法仍然比较复杂，除了在基因芯片研究方面享有盛誉的Affymetrix等公司使用该技术合成探针外，其它中小型公司大多使用合成点样法。

　　点样法是将预先通过液相化学合成好的探针、或PCR技术扩增cDNA或基因组DNA经纯化、定量分析后，通过由阵列复制器（arraying and replicating device ARD）或阵列点样机（arrayer）及电脑控制的机器人，准确、快速地将不同探针样品定量点样于带正电荷的尼龙膜或硅片等相应位置上（支持物应事先进行特定处理，例如包被以带正电荷的多聚赖酸或氨基硅烷），再由紫外线交联固定后即得到DNA微阵列或芯片。点样的方式分两种，其一为接触式点样，即点样针直接与固相支持物表面接触，将DNA样品留在固相支持物上；其二为非接触式点样，即喷点，它是以压电原理将DNA样品通过毛细管直接喷至固相支持物表面。打印法的优点是探针密度高，通常1平方厘米可打印2,500个探针；缺点是定量准确性及重现性不好，打印针易堵塞且使用寿命有限。喷印法的优点是定量准确，重现性好，使用寿命长；缺点是喷印的斑点大，因此探针密度低，通常只有1平方厘米400点。点样机器人有一套计算机控制三维移动装置、多个打印/喷印头、一个减震底座，上面可放内盛探针的多孔板和多个芯片。根据需要还可以有温度和湿度控制装置、针洗涤装置。打印/喷印针将探针从多孔板取出直接打印或喷印于芯片上。检验点样仪是否优秀的指标包括点样精度、点样速度、一次点样的芯片容量、样点的均一性、样品是否有交叉污染及设备操作的灵活性、简便性等等。

　　一、点样设备

　　Telechem公司全新SpotBot Personal Microarrayer

　　对于那些需要经常小批量使用多种不同的研究用芯片的普通用户来说，向Affymetrix样的大公司定做自行设计芯片的时间和成本太高，然而又不太可能支付得起一套高性能的大型生物芯片点样制作系统，Telechem公司最新推出的SpotBot个人微阵列点样机绝对是一个好消息。这种只有一台台式普通离心机大小(30cm x 30cm x 22cm)的个人芯片点样机功能相当完备：

　　4针的打印头(4-Pin Printhead)可以配各种Stealth点样针；

　　一次可以放置14张玻片(25mm x76mm/片)；每张片可以点3600个点(9mm x9mm区域)；

　　最大的打印范围可达20mm x 70mm；将来软件升级后每张片将可以打50400个点；

　　点样可以选择每个样品单点、双点或者3点；

　　可以放置1块384孔板，可以手工换板；

　　完成一块384孔板的点样时间为2小时(每个样品3点，14张玻片)，6小时可在14张玻片上点超过1000个样品(双点/样品)；

　　先进的自动清洗干燥台保证样品之间没有交叉污染；

　　透明罩保证点样工作环境的清洁和恒定的温度和湿度；

　　开关门感应器保证用户的安全；

　　轴运动偏差±10μm；

　　外形轻巧可爱，连真空泵和蠕动泵在内总重仅6.4公斤，

　　最令人惊喜的是价格相当便宜！

　　美国Cartesian Technology公司的MicroSys 5100小型台式芯片工作站MicroSys 5100也是专门为实验室做小量芯片研究工作设计的一套台式工作站。一次处理10张芯片，采用接触式点样技术，使用标准的CHipMaker或Stealth点样针，可放置1块96/384孔样品板，并配有一套载片真空固定系统和一套针头清洗真空干燥系统。价格低廉，非常适合经费紧缺的研究部门做芯片应用的中小型研究项目使用。

　　对于中型到大型的用户则可以选择美国Cartesian Technology公司PA系列、SQ系列生物芯片点样制作系统。这家公司在芯片技术刚出现时就致力于开发能将生物芯片变为现实的点样制作系统，并得到生物芯片技术的开创者M.Schena的支持。通过与著名的点样针制作厂家TeleChem公司联合，融合自身拥有多项专利的喷点技术，生产的芯片点样系统一直在该领域独占鳌头。

　　PA系列是应用专利的 PinArrayTM （针阵列）技术，在玻片等基质上生产高密度芯片的生物芯片点样系统，该系列的产品均使用TeleChem公司的 ChipMaker 和 Stealth 系列点样针。点阵密度可以达到2500/cm2

　　PixSys 5500 PA Workstation.

　　适用于中等工作量研究用途的点样工作站。该系列配备精密的Telechem点样针，也可同时选配synQUAD微定量喷头，点样快速、精确，适用范围广泛，使生物芯片点样系统的主流产品。

　　ProSys 5510 PA Workstation.

　　应用其专利的PinArrayTM 技术在玻璃片基上生产高密度芯片的高通量点样工作站。适用范围广，点样快速精确，自动化程度高，一次可处理100张芯片，适合大规模的工业化生产使用。

　　SQ系列生物芯片点样系统

　　SQ系列使应用其专利的synQUADTM 技术在各种类型的膜及玻片等基质上进行非接触的同步喷点系统，还可以用来进行转板等微定量液体转移工作。点样速度可达1000点/分钟。

　　二、芯片片基

　　用点样法制作芯片，除了专用的仪器外，还需要要选择合适的固相支持物--芯片片基，也就是载体材料。一般来说各种芯片片基都选择经过相应处理的硅片、玻璃片、瓷片或聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等作为支持物。作原位合成的支持物在聚合反应前要先使其表面衍生出羟基或氨基（视所要固定的分子为核酸或寡肽而定）并与保护基建立共价连接；作点样用的支持物为使其表面带上正电荷以吸附带负电荷的探针分子，通常需包被以氨基硅烷或多聚赖氨酸等。我们在下面介绍一些常见的相关产品：

　　膜：与玻片相比，膜的优点是与核酸亲和力强，杂交技术成熟，通常无需另外包被。由于尼龙膜与核酸的结合能力、韧性、强度都比较理想，以膜为基质的芯片绝大多数采用尼龙膜。Schleicher & Schuell 公司是专业生产杂交/过滤膜的公司，著名的硝酸纤维素膜即是该公司首家推出的。S&S的Nytran SuPer Charge正电荷尼龙膜带电量是常规正电荷尼龙膜的3倍，与核酸的结合力更强，而且又大大降低了背景和非特异结合，克服背景高的缺点，加上韧性强，反复杂交10次依然保持表面平整的优点，成为制作尼龙膜芯片的最佳选择。Nytran SuPerCharge有多种规格，详细资料可以向基因有限公司查询。

　　玻片：用于制作芯片的玻片必须特别清洁和平滑。玻片表面必须包被合适的功能基团能将靶DNA片段固定住并防止其在杂交洗涤过程中被冲洗掉。经表面化学处理的玻片是一种持久的载体，它可耐受高温和高离子强度；玻片具有不浸润性，使杂交体积降低到最小，因此提高了退火时的动力学参数，疏水表面可以使点密度大于亲水表面（因为亲水表面上样品点将扩散）；玻片的荧光信号本底低，不会造成很强的背景干扰；玻璃芯片可使用双荧光甚至多荧光杂交系统，可在一个反应中同时对两个以上的样本进行平行处理。由上可知，以玻璃为载体的芯片更具有发展和应用的前景。

　　S&S公司的CAST Slides(Cat.No.10484181,20/box)将SuPerCharge正电荷尼龙膜附着在玻片上，这种特殊的玻片综合了尼龙膜的高亲和力和玻片刚性的优点，是世界上第一个膜结合玻片。而FAST Slides (Cat.No.10484182,20/box)则是在玻片表面包被一种专利的聚合物，这种聚合物能迅速与DNA以非共价但是不可逆的方式结合。由于表面包被层的多孔性和厚度使单位面积的DNA结合能力比常规化学表面处理玻片要高得多，使得检测更加灵敏。其杂交方式和传统的杂交一样。适用的检测方法包括同位素检测、化学发光法和荧光检测--由于包被的多聚物有效降低对入射光的散射，FAST Slide同样适合用激光共聚焦成像系统进行荧光检测。

　　TeleChem ArrayIt Super Microarray Substrates(25mm x 76mm)采用高清洁度，超平表面的的玻片并进行化学修饰，各项技术指标居同类产品前列。SuperClean(Cat.No.SMC-25, etc.)， SuperAmine (Cat.No.SMM-25,etc.)和SuperAldehyd(Cat.No.SMA-25, etc.)三种规格可偶联核酸、蛋白、甚至细胞，且偶联过程可以在室温及中性条件下进行。

　　Clontech提供的DNA-Ready Type I Slides (Cat.No.7880-1, 5 slides/box)是氨基修饰的，能结合200bp-10kb的修饰和未经修饰的DNA，DNA-Ready Type II Slides (Cat.No.7881-1, 5 slides/box)是特殊氨基修饰的，能结合50bp-10kb的修饰和未经修饰的DNA。

　　另外CEL公司也提供醛基化修饰的玻片Silylated Slides(Cat.No.CSS-25)。

　　三、点样样品

　　点样样品的制备是非常关键的一步。样品的纯度、杂交特异性直接决定自制芯片的质量和可信度。可以说，没有好的样品，自制芯片也就没有多大意义。

　　我们在前面介绍了Clontech公司的Atlas系列，其中Glass Array和Plastic Array上那8300个基因对应的80碱基长寡核苷酸序列是经过Clontech公司专利软件在GenBank中筛选出的同源性最低，又经Clontech实验确保能给出很强杂交信号的片断。这种精巧的设计保证很高的分辨率、灵敏度，实在令人印象深刻。现在，你可以通过基因公司定购这些寡核苷酸来制作自己的芯片了。足够点1000次芯片的8327个人类基因、5002个小鼠基因或者将近4000个大鼠基因的寡核苷酸片断（冻干）放在96孔板中，连同100个Type II玻片和杂交盒，200ml杂交液，全面满足中小型实验项目的需求。这些寡核苷酸序列数目齐全，质量可靠，能为自制芯片的灵敏度和分辨率提供可靠的保证，也避免了合成8000多基因的麻烦。还有更大包装可供选择。对Atlas Nylon Array上的200-600bp的cDNA片断感兴趣的研究人员则可以选择Ready-to-Print cDNA 系列，共计5278个人类基因，3197个小鼠基因或者2727个大鼠基因（每个基因片断有3ug，分装在96孔板中），均可定购。

　　如果人、小鼠和大鼠的这些Oligo还不能满足你的需要，那么可以选择Operon公司的Array-Ready Oligo Sets。刚被QIAGEN公司收购的Operon公司是世界著名的DNA合成专家，提供包括有酵母基因组、人类基因组、小鼠基因组、疟原虫基因组和肺结核杆菌基因组的Oligo sets。所有的OligoSets都是按最新的数据而设计的。由于测序速度的提升，更多新数据涌现，Operon公司保证以后根据新数据设计的Oligos将以升级试剂盒的形式提供。

　　Yeast Genome Oligo Set里提供斯坦福大学酵母基因组数据库（SGD）中6307个酿酒酵母的开放阅读框中挑选的长度为70-mer单链寡核苷酸和10个对照，所有的序列经过BLAST保证同源性最低，避免非特异杂交。每种Oligo有2000pmol，足够点2000-6000张片。

　　Alaria Genome Oligo Set则包含整个Plasmodium falciparum疟原虫基因组6231个预测的基因或ORF对应的70-mer寡核苷酸，以及138个对照，是由加州大学的芯片专家Dr.Joe DeRisi协助设计的。数据来源是Sanger中心和TIGR以及斯坦福大学。

　　Operon公司也提供Human Genome Oligo Set，包含13971个来源于UniGene中的已知基因对应的70-mer寡核苷酸序列（Hs build 119）和29个对照。（The UniGene database automatically clusters all human Genbank sequences into a non-redundant set of genes. Similar databases are also available for the rat and mouse genomes. Each cluster in the UniGene database represents one unique gene. A cluster may contain many sequences, but one representative sequence has been selected based on the longest region of high-quality sequence data.）

　　Mouse Genome Oligo Set同样包含6868个已知基因对应的70-mer序列，数据来源也是Mouse UniGene Build 83，还有16个对照。每个Oligo的量也是2000pmol。

　　Tuberculosis Genome Oligo Set包含4295个70-mer Oligo，其中大部分是来源于Sanger中心测序的Mycobacterium tuberculosis H37RV (lab strain)基因组中预测的3924个基因，另外371个是来源于TIGR（The Institute for Genomic Research）测序的TB strain CDC-1551中和前者同源性低于97%的预测基因。

　　除了购买现成的核酸，还可以通过自己合成寡核苷酸和PCR扩增模板的方法制备点样样品。由于自己合成Oligo成本太高，只适于少量特殊样品。最常用的还是PCR扩增。一张芯片上可不只10个8个样本，少则上百多则上千个样本的质粒纯化、PCR以及PCR产物纯化，加上芯片上的样品量很有限，点样的纯度必须有保证，所以QIAGEN公司的96孔高通量核酸纯化系列是最好的选择。一次可以纯化96个样品，大大简化了上百个样本纯化的工作量和操作强度。

　　26171 R.E.A.L. Prep 96 Plasmid Kit(4x96)——高通量碱法纯化小量质粒DNA，只需60-75分钟即可纯化96个样品，需要96孔板离心机。

　　27191 QIAprep 96 Turbo Miniprep Kit(4x96)——高通量碱法纯化小量质粒DNA，采用真空抽滤的方法，只需45分钟即可纯化96个样品，无需96孔板离心机。质粒纯度高。

　　27781 QIAprep 96 M13 Kit(4x96——高通量纯化M13单链DNA，采用真空抽滤的方法，只需45分钟即可纯化96个样品。

　　28181 QIAquick 96 PCR Purification Kit--采用真空抽滤的方法，利用硅胶膜技术25分钟内从PCR反应体系中回收高纯度的DNA，回收率高达90%(100bp-10kb)，可除掉 99.5 %的引物，无需另外去除石蜡油，无需乙醇沉淀，无需酚、氯仿等有机试剂。纯化产物可直接用于芯片点样或测序。

　　Telechem 公司：世界著名的芯片供应商，提供各种芯片方面的耗材和试剂。其PCR产物纯化试剂盒利用高级滤膜技术，具有价格低、通量高、速度快等优点。无需乙醇沉淀，无需酚、氯仿等有机试剂。90%以上的回收率，99.9%的DNA纯度，孔与孔之间的交叉污染小于0.01%，每天可以纯化1000个以上的样品。

　　大规模样品纯化

　　对于较大规模制作芯片的用户，由于点样样品数目太多，即使采用这种高通量试剂盒还是不够方便。这时不妨考虑分子生物学的标准工作站--全自动核酸和蛋白纯化工作站。这可不同于那种单一样品大量纯化的系统，而是特别适合芯片制作的很多个样品小量纯化系统。

　　随着人类基因组、功能组的研究不断深入，生物芯片的研究在全世界开展的如火如荼，它已经成为进行大规模分子生物学研究的有利工具。但是在芯片飞速发展的今天，样品制备已经成为芯片发展的瓶颈所在。生物样品往往是各种组分的混合体，成分非常复杂，传统的核酸和蛋白纯化方法需要花费大量的人力、物力、财力，而且许多有机试剂会对人体造成不同的伤害。如今，您再也不用为纷繁复杂的纯化过程而烦恼了，世界上声誉卓著的核酸纯化供应商--QIAGEN公司推出了全自动核酸和蛋白纯化工作站--4个不同的自动纯化系统型号：BioRobot 8000，BioRobot 3000，BioRobot 9604，BioRobot 9600，加上QIAGEN优质的多种配套纯化试剂盒--从质粒、粘粒、RNA、血液基因组DNA、病毒DNA到蛋白，品种丰富，信誉卓著，带着德国人的严谨和自信，在欧美的生物医学市场上掀起了一场革命，各大分子生物学中心、芯片中心、医学中心争相抢购。作为国内最大的生命科学领域内的仪器和试剂供应商，我们有理由，更有责任将这套系统推荐给在生命科学领域内忘我工作的科学家，为大家分忧解难，为促进中国的生物芯片产业发展尽牵线搭桥，为缩小与欧美在生命科学领域内的差距尽一份薄力。

　　BioRobot 8000:

　　专为基因组实验室设计，同时也可以用于其他分子生物学领域。高通量、快速、全自动核酸纯化系统，功能强大的真空过柱、振荡混匀及加热制冷装置，无需离心即可进行核酸纯化。8通道自动移液系统可以对384孔板进行准确、快速地移液处理。

　　特点：

　　1、高通量核酸纯化。

　　2、速度快、全自动样品传送及液面监控。

　　3、高精确处理384孔板。

　　4、提供优质配套试剂，结果重复性好。

　　5、具有功能强大的软件处理系统。

　　6、提供配套的优质试剂

　　BioRobot 3000:

　　此系列为可根据客户的不同需求量身定做的分子生物学平台。自动移液，软件功能强大，用途广泛。主要可以应用于：基因组或质粒DNA，RNA纯化病毒DNA，RNA纯化，6×His蛋白纯化，PCR产物纯化，PCR、测序及其它反应体系准备，Re-arraying。

　　特点：

　　1、根据客户的不同需求量身定做

　　2、灵活的操作系统、满意的结果

　　3、准确的枪头定位系统（根据液面不同）和液体传输系统

　　4、可选择与其他仪器（如分光光度计）连用的自动机械臂

　　5、自动的样品跟踪和过程控制系统（条形码扫描）

　　6、简单易学的软件操作系统

　　7、提供配套的优质试剂

　　BioRobot 9604；

　　此仪器是专为临床样品和细胞培养液设计的核酸自动纯化的分子生物学工作站。可自动从临床诊断样品（各种血样，体液，口腔刮离细胞及细胞培养物等）中纯化基因组DNA、质粒DNA、RNA、病毒DNA及RNA，还可进行PCR产物纯化，PCR样品准备。适用于医院，检验科分子诊断，血库，检疫，海关病毒检测，血液分型，法医DNA指纹鉴定制药公司药物筛选等。

　　特点：

　　满足分子诊断所需DNA的标准的、自动纯化操作过程

　　满意的得率和可信的结果

　　自动的样品跟踪和过程控制系统（条形码扫描）

　　可同时进行2X96样品，且有很好的可重复性

　　可安全处理有传染性的样品

　　配套的高质量试剂

　　简单易学的软件操作系统

　　BioRobot9600：

　　此仪器是为常规分子生物学研究设计的核酸纯化工作站。可以进行质粒DNA，RNA纯化病毒DNA，RNA纯化， PCR产物纯化，PCR、测序及其它反应体系准备，Re-arraying。

　　特点：

　　分子生物学标准的、自动核酸纯化操作过程