杂交

杂交

　　互补杂交要根据探针的类型、长度以及研究目的来选择优化杂交条件。如用于基因表达检测，杂交时需要高盐浓度、样品浓度高、低温和长时间(往往要求过夜)，但严谨性要求则比较低，有利于增加检测的特异性和低拷贝基因检测的灵敏度；若用于突变检测，要鉴别出单碱基错配，需要故需要在短时间内(几小时)、低盐、高温条件下高严谨性杂交。多态性分析或者基因测序时，每个核苷酸或突变位都必须检测出来，通常设计出一套四种寡聚核酸，在靶序列上跨越每个位点，只在中央位点碱基有所不同，根据每套探针在某一特点位点的杂交严谨程度，即可测定出该碱基的种类。

　　杂交反应还必须考虑杂交反应体系中盐浓度、探针GC含量和所带电荷、探针与芯片之间连接臂的长度及种类、检测基因的二级结构的影响。有资料显示探针和芯片之间适当长度的连接臂可使杂交效率提高150倍。连接臂上任何正或负电荷都将减少杂交效率。由于探针和检测基因均带负电荷，因此影响他们之间的杂交结合，为此德国癌症研究院的Jorg Hoheisel等提出用不带电荷的肽核酸（PNA）做探针效果更好。虽然PNA的制备比较复杂，但与DNA探针比较有许多特点，如不需要盐离子，因此可防止检测基因二级结构的形成及自身复性。由于PNA-DNA结合更加稳定和特异，因此更有利于单碱基错配基因的检测。我们在这里简单介绍一些常用杂交试剂和消耗品

　　对于商品化的芯片和Array类产品，通常都有配套的杂交试剂以方便使用。例如：

　　1. Clontech公司的Altas Glass Microarrays，产品已经包含GlassHyb Hybridization Solution和GlassHyb Wash Solution，能有效缩短杂交时间，提高信噪比。同时还提供了方便使用的Altas Glass Hybridization Chamber，旋盖式的设计和1.8ml的容积，避免了传统coverslip式杂交盒的弊端。可以单独购买。

　　7899-1 Altas Glass Hybridization Chamber each

　　8016-1 GlassHyb Hybridization Solution 50ml

　　2. Clontech ExpressHyb Hybridization Solution快速杂交液能有效加快杂交速度，减少杂交时间，同时提高灵敏度。适用于各种基于膜的核酸杂交反应，如cDNA Array、Southern、Northern、菌落原位杂交，特别是Clontech公司的Altas系列、MTN系列、MTE系列的各种膜基质的Macroarray。在 这些系列的产品中均配有快速杂交液样品。由于膜可以反复使用，通常需要另外购买快速杂交液。

　　8015-1 ExpressHyb Hybridization Solution 250ml

　　8015-2 ExpressHyb Hybridization Solution 500ml

　　3. 对于自己制作的芯片，可以自行配置杂交缓冲液，也可以参考Ambion公司提供的几种Glass Array 杂交缓冲液。SlideHyb Glass Array Hybridization Survey Kit是专为玻片或者尼龙膜基质的玻片DNA Array优化杂交条件而设计的。由于芯片的杂交条件受多种因素的影响，Ambion认为很难找到适用于所有芯片的杂交缓冲液。在这个试剂盒中提供了4种严谨程度不同的杂交液，供不同的需要。1号缓冲液的杂交条件是最严谨的，背景最低，2、3号的灵敏度相应提高而背景也相应升高，4号缓冲液没有去垢剂。这些杂交液可以单独购买，连预先配好的SDS、SSC等常用缓冲液都可以在Ambion买到。毕竟在芯片这样精密的实验中，在这么小的一个点上的DNA的量是非常有限的，要得到理想的结果需要非常精确的反应条件。Ambion 同样提供芯片杂交盒，抗化学腐蚀，耐70度高温，一次可放三张片。

　　Cat.No. Product Name Size

　　1860 SlideHyb™GlassArray Hybridization Survey Kit 100rxns

　　8861 SlideHyb™ Glass Array Hybridization Buffer#1 5 x 2 ml

　　8862 SlideHyb™ Glass Array Hybridization Buffer #2 5 x 2 ml

　　8863 SlideHyb™ Glass Array Hybridization Buffer #3 5 x 2 ml

　　8864 SlideHyb™ Glass Array Hybridization Buffer #4 5 x 2 ml

　　10040 Glass Array Hybridization Cassette 1 each

　　4. Ambion同样提供适用于各种核酸膜杂交的杂交液和Wash Buffer，精心优化的反应条件有效提高杂交灵敏度和降低背景，已经经过ULTRArray (Ambion), Atlas(Clontech)，LifeGrid (Incyte Genomics), GeneFilter (Research Genetics), and Panorama (Sigma-Genosys) arrays等产品验证。

　　Cat# ProductName Size

　　7118 Yeast RNA 10 x 10 mg/ml

　　8665 ULTRArray™ Hybridization Buffer 225 ml

　　8666 ULTRArray™ Hybridization Buffer 500 ml

　　8667 ULTRArray™ Low Stringency Wash Buffer 1 L

　　8668 ULTRArray™ High Stringency Wash Buffer 1 L

　　9680 Salmon Sperm DNA (sheared) 10x10 mg/ml

　　9763 20X SSC 1 L

　　9765 20X SSC 4 x 1 L

　　9780 RNaseZap™ 250 ml