精制抗狂犬病血清制造及检定规程

精制抗狂犬病血清制造及检定规程

　　本品系由狂犬病固定毒免疫马的血浆，经胃酶消化后用硫酸铵盐析法制得的液体或冻干免疫球蛋白制剂。仅用于配合狂犬病疫苗对被疯动物严重咬伤者进行预防注射。对已有狂犬病临床症状的，注射本制品无效。

　　1 制造

　　1.1对血浆的要求

　　1.1.1 用于制造精制抗狂犬病血清的血浆除须按附录1《抗狂犬病血清生产用马匹免疫方法》中的要求外，应符合《抗毒素生产用马匹免疫方法》的规定。在保存期间如发现明显的溶血、染菌及其他异常现象，不得投入生产。

　　1.1.2 血浆的中和效价不得低于80IU/ml。

　　1.2 制造程序

　　按《精制抗毒素制造及检定规程》中1.2项进行。

　　1.3 制造工艺的要求及规定

　　按《精制抗毒素制造及检定规程》中1.3项进行。

　　1.4 半成品检定

　　按《精制抗毒素制造及检定规程》中1.4项进行。

　　2成品检定

　　由质量检定部门进行全面检定，半成品已会同检定的项目可抽检。

　　2.1 鉴别试验

　　按《精制抗毒素制造及检定规程》2.1项进行。

　　2.2理化检定、无菌试验、安全试验、热原质试验及类A血型物质测定等项均按《精制抗毒素制造及规定规程》中2.2～2.6项规定进行。

　　2.3 效价测定

　　2.3.1 按《精制抗狂犬病血清效价测定方法》（附录2）进行。效价测定用血清标准品由中国药品生物制品检定所分发或认可。

　　2.3.2 效价要求

　　精制抗狂犬病血清效价在200IU/ml以上为合格。

　　3保存与效期

　　保存于2～8℃。自效价测定合格之日起，液体制品效期为3年；冻干制品效期为5年。

　　附录1抗狂犬病血清生产用马匹免疫方法

　　1 马匹

　　用于免疫采血之马匹必须符合《生物制品生产用马匹检疫及管理规程》的规定。

　　2 抗原及佐剂

　　2.1基础免疫用抗原

　　用羊脑死毒抗原或羊脑固定毒抗原，灭活前病毒滴度应在7.0Log/1.0ml以上。

　　2.2 超免疫用抗原

　　用羊脑固定毒抗原或细胞培养疫苗抗原。

　　2.3 所用抗原及佐剂不得含有人体成分。

　　3 免疫与采血

　　3.1马匹免疫采血参照《抗毒素生产用马匹免疫方法》中有关规定进行。

　　3.2基础免疫

　　在超免疫前应适当进行基础免疫。

　　3.3 超免疫

　　基础免疫1月后可进行超免疫。

　　3.4 采血指标

　　血清效价在100IU/ml以上。

　　4 效价测定方法

　　按《精制抗狂犬病血清效价测定方法》（附录2）进行。

　　附录2精制抗狂犬病血清3效价（IU）测定方法

　　1 中和用病毒悬液的制备

　　要求中和用病毒悬液经37℃水浴作用1小时的LD₅₀在32～320之间。

　　1.1病毒株的选择：选用CVS毒种。

　　1.2 病毒株的传代：取CVS毒种（一般为冻干毒种）制成10-2悬液，脑内接种体重10～12g健康小白鼠0.03ml，待发病后取脑再制成10-2悬液，接种于小白鼠脑内进行传代，一般传至2～3代即可制成冻干中和用病毒或–70℃冻存的中和用病毒，但要选用小白鼠在第5天发病并麻痹的服制备。

　　1.3 冻干病毒的制备：用第5天发病并麻痹的鼠脑以脱脂牛乳研磨稀释成20%的脑悬液，按0.5ml分装安瓿冻干后真空封口，存-30℃待用。

　　1.4-70℃冻存病毒的制备：用第5天发病并麻痹的鼠脑用20%小牛血清磷酸盐缓冲液研磨稀释成10-1悬液，经2000r/min20分钟沉淀，取上清混匀后分装小管，存-70℃冰箱待用。

　　1.5 病毒悬液的预测

　　1.5.1冻干病毒的预测：取含20%脑悬液的冻干病毒，启开后加入含2%小牛血清PBS1.0ml，吹打均匀后再用4.0ml上述稀释液与病毒液充分混匀，1500r/min沉淀10分钟，取上清与等量的稀释液混合则为10^-2悬液，然后再用10^-3、10^-4、10^-5、10^-6稀释，从10^-6至10^-2各取0.5ml加入5个小管内，每管再加入2%小牛血清PBS0.5ml，放置37℃水浴一小时。用体重10~12g小白鼠30只，分成5组，每组6只，经用37℃作用的10^-6至10^-2病毒悬液接种小白鼠，每个稀释度接种6只小白鼠，每只小白鼠脑内接种0.03ml，观察14天，每天观察小白鼠发病死亡情况，接种后4天内死亡的小白鼠按非特异性死亡计。以接种5天后的发病死亡小白鼠统计LD50。

　　1.5.2-70℃冻存病毒悬液的预测：取含10%脑悬液的冰冻病毒用流水融化后即为10-1悬液，然后再做10-2至10-7稀释。从10-7至10-3各取0.5ml加至5个小管内，每管再加入2%小牛血清PBS0.5ml，放置37℃水浴1小时，用体重10～12g小白鼠30只，分成5组，每组6只，用经37℃作用的10^-7至10^-3病毒悬液接种小白鼠，每个稀释度接种小白鼠6只，每只小白鼠脑内接种0.03ml，观察14天，每天观察小白鼠发病死亡情况。接种后4天内死亡的小白鼠按非特异性死亡计。以接种5天后的发病死亡小白鼠统计LD₅₀。

　　1.5.3按以上二种病毒的悬液预测的结果计算LD₅₀。将用其100个LD₅₀的病毒稀释度作为中和用病毒悬液稀释倍数，用于小白鼠中和试验。

　　2 小白鼠的准备

　　用作中和试验的小白鼠必须是未进行过其他试验的健康小白鼠，体重为10～12g。

　　3 中和试验

　　3.1狂犬病血清中和试验用的血清参考标准品：由中国药品生物制品检定所提供，或用经检定所认可的各生产单位工作用参考标准品。

　　3.2待检定血清样品的稀释：取有代表性的血清样品，按二倍连续稀释的方法用2%小牛血清PBS进行稀释，一般可采用1∶800、1∶1600…1∶102400，但可根据血清实际效价的情况适当减低或提高试验时最低稀释倍数，如采用上述8个稀释倍数，则用待检血清按2.7ml稀释液加入0.3ml血清作为1∶10，然后再用3.5ml稀释液加入混匀的1∶10倍的血清0.5ml为1∶80，再按2.7ml稀释液加入0.3ml为1∶800。然后均按0.5ml加0.5ml稀释的方法制成1∶800、1∶1600…1∶1024008个稀释倍数，以上8个稀释倍数的不同稀释度分别以0.5ml加入8个小试管内待用。

　　3.3 效价检定用血清标准品的稀释：方法同待检血清样品的稀释。如用检定所的85RS国家标准品，稀释度应从1∶80开始，其国际单位为26.53/ml。

　　3.4 中和用病毒悬液的制备：按病毒悬液预测的100个LD50的稀释度作为中和用病毒悬液。

　　3.5 中和：将上述3.2项的8个稀释度的各装0.5ml的8支小试管和3.3项的8个稀释度的各装0.5ml的8支小试管共16支小试管各加入中和用病毒悬液0.5ml，放置37℃水浴1小时，作注射小白鼠用。另用相同体重的小白鼠测定中和用病毒悬液的实际LD50。其方法可将中和用病毒悬液作为原液再稀释10-1、10-2、10-3四个稀释度，以上4个稀释度各加入0.5ml于小管内，每管再加入2%小牛血清PBS0.5ml，同样放置37℃水浴1小时作为中和病毒对照。

　　3.6接种小白鼠：将已中和的待检血清和血清标准品的不同稀释度的悬液和病毒对照接种小白鼠，血清按从浓到稀的倍数接种小白鼠，而病毒对照则按从稀到浓的倍数接种小白鼠。每只小白鼠脑内接种0.03ml。

　　3.7 观察：共观察14天，每天记录小白鼠的发病死亡情况，接种后4天死亡的小白鼠作为非特异性死亡计。

　　4 待检血清效价

　　按下列公式计算：

　　相对效力=待检血清ED50的倒数/血清标准品ED50的倒数

　　血清效价（IU/ml）=相对效力×血清标准品的国际单位

精制抗狂犬病血清使用说明书

　　本品系由狂犬病固定毒免疫马的血浆，经胃酶消化后用硫酸铵盐析法制得的液体或冻干免疫球蛋白制剂。仅用于配合狂犬病疫苗对被疯动物严重咬伤如头、脸、颈部或多部位咬伤者进行预防注射。

　　液体制剂为无色或淡黄色的澄明液体，含硫柳汞防腐剂，久置可析出少量能摇散的沉淀。冻干制剂为白色或乳白色的疏松体，按标签规定量加灭菌注射用水溶化后呈无色或微黄色的澄明液体。

　　使用对象

　　被疯动物咬伤后注射愈早愈好。咬后48小时之内注射本品，可减少发病率。对已有狂犬病症状的患者，注射本品无效。

　　用法

　　1.受伤部位应先进行处理。若伤口曾用其他化学药品处理过时，应冲洗干净。先在受伤部位进行浸润注射，余下的血清进行肌内注射（头部咬伤可注射于颈背部肌内）。

　　2.注射量均按体重计算，每kg体重注射40IU（特别严重者可酌情增至80～100IU），在1～2日内分数次注射，注射完毕后开始注射狂犬病疫苗。亦可同时注射狂犬病疫苗。

　　注意事项

　　1.本品有液体及冻干两种剂型。

　　2.制品混浊、有摇不散的沉淀、异物或安瓿有裂纹、标签不清、过期失效者均不可使用。安瓿打开后应一次用完。冻干制口应加标签规定量灭菌注射用水，轻摇使完全溶解。

　　3.每次注射须保存详细记录，包括姓名、性别、年龄、住址、注射次数、上次注射后的反应情况、本次过敏试验结果及注射后反应情况、所用抗血清的生产单位名称及批号等。

　　4.使用抗血清须特别注意防止过敏反应。注射前须详细询问既往过敏史，凡本人及其直系亲属曾有支气管哮喘、枯草热、湿疹或血管神经性水肿等病史，或对某种物质过敏，或本人过去曾注射过马血清制剂者，均须特别提防过敏反应的发生。

　　注射前必须做过敏试验

　　1.过敏试验：用氯化钠注射液将抗血清稀释10倍（0.1ml抗血清加0.9ml氯化钠注射液）。在前臂掌侧皮内注射0.05ml，观察30分钟。注射部位无明显反应者，即为阴性，可在严密观察下直接注射抗血清。如注射局部出现皮丘增大、红肿、浸润，特别是形似伪足或有痒感者，为阳性反应，必须用脱敏法进行注射。注射局部反应特别严重或除局部反应外并伴有全身症状，如荨麻疹、鼻咽刺痒、喷嚏等，为强阳性反应，则采用脱敏注射，并做好一切准备，一旦发生过敏休克，立即抢救。

　　无过敏史或过敏反应阴性者，也并非没有发生过敏休克的可能。为慎重起见，可先注射小量于皮下进行试验，观察30分钟，无异常反应再将全量注射于皮下或肌内。

　　2.脱敏注射法：在一般情况下，可用氯化钠注射液将抗血清稀释10倍，分小量数次作皮下注射，每次注射后观察20～30分钟。第1次可注射1ml，观察无紫绀、气喘或显著呼吸短促、脉搏加速时，即可注射第2次2ml，如注射量达到4ml仍无反应，可缓慢地将全量注入。

　　门诊病人注射抗血清后须观察至少30分钟方可离开。

　　过敏反应处理

　　1.过敏休克：可在注射中或注射后数分钟至数十分钟内突然发生。患者突然表现抑郁或烦躁，脸色苍白或潮红，胸闷或气喘，出冷汗，恶心或腹痛，脉搏细速，血压下降，重者神志昏迷或虚脱，如不及时抢救可以迅速死亡。轻者注射肾上腺素后即可缓解；重者须输液输氧，使用升压药物维持血压，并使用抗过敏药物及肾上腺皮质激素等进行抢救。

　　2.血清病：主要症状为荨麻疹、发热、淋巴结肿大、局部浮肿。偶有蛋白尿、呕吐、关节痛，注射部位可出现红斑、搔痒及水肿。一般系在注射后7～14天发病，称为迟缓型；亦有在注射后2～4天发病，称为加速型。对血清病应进行对症疗法，可使用钙剂或抗组织胺药物。一般数日至十数日即可痊愈。

　　保存

　　保存于2～8℃暗处。