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青霉素酶及其活力测定法
附录序号
附录Ⅺ
内容全文
B. 青霉素酶及其活力测定法
培养基 胨 15g 甘油 50g 氯化钠 4g 0.1％硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)溶液 0.5ml 枸橼酸钠 5.88g 20％硫酸镁(MgSO4·7H2O)溶液 1ml 磷酸氢二钾 4g 肉浸液 1000ml
混合上述成分，调节pH值使灭菌后为7.0～7.2，分装于500ml锥形瓶内,每瓶80ml,在115℃灭菌30分钟。
酶溶液的制备
取蜡样芽孢杆菌［Bacillus
cereus
CMCC(B)63301］的斜面培养物,接种至上述一瓶培养基内,在25℃摇床培养18小时后，取此培养物接种至其余各瓶培养基内，每瓶接种10ml，同时每瓶加入无菌青霉素4500单位，在25℃摇床培养24小时，再加无菌青霉素2万单位，继续培养24小时，再加无菌青霉素2万单位,继续培养24小时,离心沉淀菌体，调pH值至约8.5,用滤柱滤过除菌，滤液用无菌操作调pH值至近中性后，分装于适宜容器内，在10℃以下贮存，备用。
酶活力测定法
青霉素溶液
称取青霉素钠（钾）适量，用磷酸盐缓冲液(pH7.0)溶解成每1ml中含青霉素1万单位的溶液。
青霉素酶稀释液
取青霉素酶溶液，按估计单位用磷酸盐缓冲液(pH7.0) 稀释成每1ml中约含青霉素酶8000～12 000单位的溶液，在37℃预热。
测定法
精密量取青霉素溶液50ml,置100ml量瓶中，预热至37℃后，精密加入已预热的青霉素酶稀释液25ml，迅速混匀，在37℃准确放置1小时，精密量取3ml，立即加至已精密量取的碘滴定液(0.01mol/L)［精密量取碘滴定液(0.1mol/L)10ml，置100ml量瓶中，用醋酸钠缓冲液(pH4.5)稀释至刻度］25ml中,在室温暗处放置15分钟，用硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/L) 滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失。
空白试验
取已预热的青霉素溶液2ml，在37℃放置1小时，精密加入上述碘滴定液(0.01mol/L)25ml，然后精密加青霉素酶稀释液1ml，在室温暗处放置15分钟，用硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/L)滴定。按下式计算：
E＝(B－A)×M×F×D×100
式中
E为青霉素酶活力，（单位／ml）／小时；
B为空白滴定所消耗的上述硫代硫酸钠滴定液的容量，ml；
A为样品滴定所消耗的上述硫代硫酸钠滴定液的容量，ml；
M为硫代硫酸钠滴定液的浓度，mol/L；
F为在相同条件下，每1ml的上述碘滴定液(0.01mol/L)相当于青霉素的单位数；
D为青霉素酶溶液的稀释倍数。
［附注］
磷酸盐缓冲液(pH7.0)
取磷酸氢二钾7.36g与磷酸二氢钾3.14g,加水使成1000ml。
醋酸钠缓冲液(pH4.5)
取冰醋酸13.86ml,加水使成250ml;另取结晶醋酸钠27.30g,加水使成200ml，两液混合均匀。
