要想知道ODN的分辨力，就必须知道它们的作用机制，这种机制可能随细胞类型的不同而不同，也可能依赖于靶RNA或ODN的特性。不过，在许多体系中，靶RNA都能因RNase h的作用而被消耗。RNase h的活性切割DNA-RNA杂交体中的RNA成分，它们并不需要长的杂交区作为底物，实际上，在体外RNase h切割的对象可以只有4个碱基对。对于标准的ODN来说，10个碱基对对人类也就足够了；在经化学修饰过的核苷酸中，少至7个碱基对就可被切割。对每一个10碱基核苷酸顺序来讲，在人类基因组中平均有3000个拷贝，因此，任何特异的10碱基出现在许多个RNA中的可能性是极大的。当一个互补于这样的一个10碱基的ODN被导入细胞时，所有含有这些10碱基的RNA都有被RNase h切割的风险。当然，并不是所有的3000个拷贝都会被切割，这是因为许多拷贝可能并不出现于转录物中，而出现在转录物中的也会有许多是RNase h无法接近的。但是，即使是3000个拷贝中的1%被击中的话，也会直接影响到30个基因。而且，有两个原因使得“风险”基因的数目数超过3000个；①典型的ODN平均含有20个或更多的碱基，每20个碱基含有11个10碱基，而每一个10碱基平均会出现3000次；②RNase h可能不需要10个连续的碱基对就能完成切割。因为RNase h只需要很小的杂交区，所以不能通过增加ODN长度来增加其特异性。实际上，由于会使错配顺序更稳定的结合，大于最小值的长度可能会有反作用。
在对非洲爪蟾卵母细胞的研究基础上，人们发现只想让目的靶RNA被切割，而不同时发生至少是部分非靶RNA被切割的情况恐怕是不可能的。目的与非目的靶RNA被击中的比率依赖于一些复杂的因素，这些因素决定了反义分子与靶目标是否并存以及RNA内的互补部位是否被掩盖或是被分子键作用而使它们不可接近。将来，即使是反义化学的发展降低了ODN与蛋白质的结合，由RNase h导致的对特异性的限制还将存在，在评价反义策略时必须牢记这一点。
核酶对靶部位识别也是由Watson-Crick法则决定的，因此，与ODN一样，它也有类似的特异性方面的局限性。核酶通过识别不同长度的顺序与靶RNA结合。一个与靶RNA能形成较多数目碱基互补的核酶，并不比那些识别相对较短顺序的核酶具有更强的对目的靶RNA的分辨力。实际上，延长识别顺长度反而会降低核酶的分辨力。目前正在研究是否存在这样一种顺序，既短到能分辨与靶RNA相差一个碱基的RNA而使其不被切开，又长到允许一个单一的RNA可以被选择性的破坏。核酶能击中单一基因这一情况并不让人感到惊讶。大部分核酶都是槌头或发夹状分子，自然状态下，可以共价地结合在其切割部位上，自身切割病原体亚病毒（类病毒）的前体分子。为了充分起作用，核酶从同样小的RNA分子的有限数目的碱基中选择其切割部位。因此，人工合成的核酶比自然形成的核酶有更高的特异性。当然，象其它RNA一样，核酶有与细胞蛋白结合的可能性，因此，会产生显著的非反义生物学效应。
当考虑反义特异性的理论局限性时，需牢记基因组并不是一个“随机的顺序”。一个RNA中含有的“好”的反义靶顺序在另一些RNA中出现的机率会比预测的更高或更低。应用生物顺序的趋势可能会限制这种只依靠Watson-Crick互补法则的策略的特异性，随着对人类基因顺序完整数据的获得，这种倾向性会得到更细致的分析。
六、反义介导的基因剔除原则
在细胞内，不能通过体外经常采用的诸如提高温度，或改变离子强度以降低核苷酸杂交背景的策略来提高特异性。因此，需要一些其它的策略来提高细胞内的特异性。有一种方法被用来设计多重反义复合物，复合物中的每一亚单位都直接作用于同一个靶RNA的不同部位，通过分子三角关系将其消灭。除此之外，还有一些工作解决了RNA分子中所有部位不同等暴露这一问题。如果与反义ODN互补的10碱基出现在靶RNA的可接近区，又在无关RNA的被保护区，靶RNA就会被优先消耗掉。而鉴别互补于靶RNA脆性部位的反义分子是很难做到的，因为RNA是一种内部结构错综复杂的分子。
最近的研究强调了RNA内结构限制其与ODN结合的程度。人们发现能与mRNA稳定结合的ODN极少，这些结果指出这种结合可能只发生在RNA可被接近的区域，靶RNA结构是决定反义分子特异性的主要因素。象ODN一样，核酶的靶部位的可接近的区域，靶RNA结构是决定反义分子特异性的主要因素。象ODN一样，核酶的靶部位的可接近性也有变化。细胞蛋白及核糖核酸蛋白复合物，如核糖体，会防碍核酶介导的切割作用，那种认为“核酶扩散，结合随后切割非结构RNA这种容易的过程似乎是过于简单了”。因为预测在体内RNA分子的哪一部分能被接近是很困难的，必须筛查大批候选者才能找出能在细胞内起作用的反义分子。
七、设计反分子的策略
在任何时刻，RNA固有的结构以及它们与蛋白质的结合都限制了RNA分子中可接近部位的数目，因此为特异性提供了基础。结合象一件稀有的例外事件，反义分子被排除在大多数互补部位之外。因为这种可接近性是无法预测的，合理的设计反义分子是不可能的。由于缺少设计法则，需要经过更精细的耗时、耗资过程，从20~50个候选者中选出有效的反义分子。如果说对50个分子的检测能找出好的候选者，对上千个复合物的检测会找出更好的。但如何设计它们呢？它们的顺序仅仅依靠于能与靶RNA形成线性的Watson-Crick互补呢？还是象自然存在的反义TNA一样包含切割部位？又该如何看待非规范的碱基配对作用和象茎-套这样的结构呢？
有关体外情况下ODN结合的可接近性与在体内ODN介导的反义抑制的脆弱性之间的关系正在进行探讨，而且也将成为未来研究的一个领域。还不清楚体外筛查技术是否同样能鉴别出在体内起作用的ODN。有许多可能的顺序需要选择，看起来体外研究并不总能预测在体内时的有效性，还需要开发能应用于细胞内的更新的筛查技术。
八、结论
随着许多非反义效应的作用机制的发现
