2 结果
2.1TUNEL原位杂交检测光镜观察可见凋亡细胞胞浆减少、体积变小、固缩，阳性信号呈深蓝色、团块状分布于细胞内或细胞核中。SMMC7721/PMTrneo细胞较对照组细胞的凋亡数量显著增多(图1)。在高倍视野下，选择5个视野分别计数200个细胞，计算凋亡细胞所占百分比。发现SMMC7721/PMTrneo细胞组凋亡细胞为24±4/200(12％)，比对照组(8±3/200,4％)明显增多，统计学检验表明，发生凋亡的细胞数量在两组细胞之间有显著的差别(P∨0.01，2=7.643)。
2.2免疫组化检测光镜观察bcl-2，p16和p21蛋白主要分布在细胞浆中，p16和p21蛋白也可分布在细胞核中，阳性信号呈棕黄色颗粒。在SMMC7721/PMTrneo细胞中，未能检测到bcl-2蛋白，而对照组bcl-2结果为阳性，说明在Zn2＋诱导下bcl-2核酶有效表达,在转录水平上封闭了bcl-2mRNA的表达。免疫组化检测p16和p21蛋白的表达发现，在对照组细胞中p16和p21的表达呈弱阳性，且阳性表达细胞数少，分布散在；而在SMMC7721/PMTrneo细胞中p16和p21的表达呈强阳性，且阳性表达细胞数多、分布均匀(图2)。图像分析测定两组免疫组化染色中p16，p21阳性细胞的A值，SMMC7721/PMTrneo细胞组分别为：0.23±0.06，0.26±0.02；对照组分别为：0.18±0.02，0.19±0.03。SMMC7721/PMTrneo细胞组较对照组细胞表达p16和p21蛋白的水平显著增高，统计学检验表明，p16和p21的表达程度在两组细胞之间均有显著的差别(P均∨0.05)，提示通过转染bcl-2核酶抑制bcl-2表达后,p16与p21的表达水平有明显的增加。
3 讨论
抗凋亡基因bcl-2是肿瘤研究中最受关注的癌基因之一。研究发现，bcl-2过量表达可阻断多种刺激引起的细胞凋亡，延长细胞的生存期；抑制bcl-2的表达，可在多种肿瘤中引起细胞凋亡〔1－3〕。对凋亡调控的研究发现，bcl-2的抗凋亡作用主要是通过竞争性形成不同的二聚体形式而发挥作用〔4－5〕。例如，bcl-2与bak结合成杂交二聚体，便可以抑制bak的促凋亡作用。最近研究还表明，bcl-2可阻止细胞进入细胞周期及引起细胞对化疗药物的抗性。因此，对bcl-2更深入地研究具有重要的意义。本实验将带有锤头状bcl-2核酶的可诱导的真核表达载体〔11〕，通过脂质体介导方法转入SMMC7721培养细胞中,通过bcl-2核酶来阻断bcl-2基因表达。结果表明，转染bcl-2核酶的SMMC7721细胞表达bcl-2的水平显著下降。用免疫组化法未能检出SMMC7721细胞中有bcl-2蛋白；用TUNEL原位杂交方法检测到转染细胞发生显著凋亡。有关bcl-2核酶对肿瘤细胞的促凋亡作用，文献报道结果不一。Dorai等〔6－7〕观察到bcl-2核酶对前列腺癌细胞有明显的促凋亡作用；而有人发现bcl-2核酶对慢性髓细胞白血病细胞无明显的促凋亡作用〔8〕。我们的实验结果与Dorai等的结论相似，说明bcl-2核酶对肝癌细胞有一定的促凋亡作用，验证了bcl-2抑制凋亡的作用。同时我们观察到，转染bcl-2核酶的细胞中p16和p21的表达水平增加。p16和p21均在细胞周期调控表达中起重要作用，均属于细胞周期蛋白激酶抑制蛋白，对G1/S转换起负调节作用〔9－10〕。p16和p21通过影响CDK的活性可阻止细胞进入S期；p21在转录水平还受P53调控。因此，可以推测bcl-2核酶封闭bcl-2基因表达后，可引起p16和p21表达水平的增加，进而可能会影响细胞周期调控，G1/S期转换受阻；同时，由于bcl-2基因表达受抑或降低，相对表达增加的p53可上调p21表达，加剧细胞凋亡。由于对bcl-2核酶进入细胞后的表达情况不清楚,我们推测，通过转染bcl-2核酶抑制bcl-2表达后,p16与p21表达水平的增加可能是继发性的，对此有待于更深入地研究。■
作者简介：张传山，男，33岁，博士生西安市长乐西路17号 ，Tel.(029)3374541-115(O) 2000 by J Cell Mol Immunol Press www.immunology. net/jcmi; Email. [email protected]
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