(四) 过氧化氢酶活性测定 对破菌液上清进行过氧化氢酶活性的初步测定。用磷酸盐(K2 HPO4+KH2PO4,0.1 mol/L)与NaCl(2 mol/L)的缓冲液配制10%的Tween 80溶液，取 5 ml 与30%的双氧水5 ml混合。分对照管与katG管，在katG管内加入不同容积的含pET-katG表达 质粒的菌株破菌上清(20、40、80、160 μl)，对照管 则加入含pET空载体的菌株破菌上清，10 min后观察气泡产生情况。如产生大量气泡则提示 酶活性较佳。
结 果
一、重组katG蛋白的诱导表达以及产物的鉴定分析
将含有katG基因的pET24b-katG表达质粒转化大肠杆菌，在IPTG诱导下表达，分别对不同诱 导时间的表达产物进行SDS-PAGE以及考马斯亮蓝染色，可在相对分子质量80 000处见一诱 导表达带 (图1)。比较不同诱导时间的表达产量可以发现，经诱导2 h后的表达产量已达到峰值。在其 后蛋白纯化中即可选取该诱导时间的产物。对此诱导表达带进行黑度密度自动扫描分析，此 处表达蛋白量约占总菌体蛋白量的17.7%。
二、重组katG基因表达产物的纯化结果
采用Xpress TM蛋白纯化系统进行纯化发现，分别以不同浓度的咪唑洗脱液(50、 200、350、500 mmol/L)洗脱纯化柱后，所收集的洗脱液再次进行SDS-PAGE分析。结果发现 ，以350 mmol/L咪唑洗脱后纯化的效率最高，通过SDS-PAGE黑度密度自动扫描分析可以发 现纯化率可达90%以上。
三、对katG基因表达产物的过氧化氢酶活性测定结果
在过氧化氢反应系统中加入不同容积的破菌上清(20、40、80、160、320 μl)，比较气泡产 生情况，发现加入含pET-katG表达质粒的菌株破菌上清的各管均有气泡产生，且均较对照 管为明显，而以加入量为160 μl与320 μl的反应管产生气泡最为显著。提示重组katG表达 产物具有过氧化氢酶活性。
讨 论
结核分支杆菌的katG在INH的抗结核作用机制中起着关键作用。研究表明INH实际上是一个 药物前体，需经结核分支杆菌过氧化氢酶-过氧化物酶活化后 才发挥抗结核作用，而katG则由katG基因所编码［4］。有研究 通过质粒将katG基因转移到INH耐药菌株胞内，可令其对INH重新恢复敏感性。而对结核分支 杆菌的临床耐异烟肼菌株进行katG基因分析亦发现该基因的缺失或突变是引起耐药的主要原 因［5］。然而对于katG如何活化INH以及katG发生变异后导致耐药的 确切机制仍然 不清，特别是近年来对于不同突变位点变异对药物敏感性的影响程度颇有争议［6］ ，因此在蛋白水平研究katG的作用环节与耐药机制，以及比较不同位点 基因突变对酶结构与活性的影响等方面进行研究可深入了解INH耐药的发生机制，进而可 能在蛋白水平找到消除耐药的途径。由于结核分支杆菌生长较缓，而且具有较强的传染性， 长期以来在提取结核分支杆菌蛋白进行研究的进展较缓。本研究通过基因重组的katG表达载 体转化到大肠杆菌后产生高表达的katG蛋白，相对分子质量约为80 000，表达量可占总菌体 蛋白的17.7%。表明该基因重组的菌株为katG的高表达菌株，对表达产物进行初步过氧化氢 酶活性研究验证了其酶活性。进一步对表达产物进行纯化后可提取到纯度超过90%的katG蛋 白。本研究为进一步研究katG蛋白、katG对异烟肼的活化机制以及为检测katG变异耐药菌株 奠定基础，并且对深入阐明INH的耐药产生机制与寻求消除耐药的方法有较大的意义。
本课题为国家自然科学基金资助项目(39970672)
参考文献
1，Rouse DA, Li Z, Bai GH, et al. Characterization of the KatG a nd inhA genes of isoniazid-resistant clinical isolates of Mycobacterium tuber culosis. Antimicrob agents Chemother, 1995， 39:2472-2477.
2，Zhang Y, Heym B, Allen B, et al. The catalase-peroxidase gene and isoniazid resistance of Mycobacterium tuberculosis. Nature, 1992, 358:591-593.
3，Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T，著. 分子克隆实验指南.金冬雁，黎孟枫，译. 第2版. 北京：科学出版社，1992.
4，Telenti A, Honore N, Bernasconi C, et al. Genotypic assessment of isoniazid a nd rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis: a blind study at refer ence laboratory level. J Clin Microbiol, 1997, 35:719-723.
5，Stoeckle MY, Guan L, Riegler N, et al. Catalase-peroxidase gene sequences in isoniazid-sensitive and resisitant stains of，M.tuberculosis from New York City. JID, 1993,168:1063.
6，Rouse DA, DeVito JA, Li Z, et al. Site-directed mutagenesis of the K atG gene of mycobarterium tuberculosis: effects on catalase-peroxidase activite s and isoniazid resistance. Mol Microbiol. 1996, 22:583-592.
