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疟疾核酸免疫的研究进展 2

来源:医学杂志 2006-12-09 09:21:41 

种质粒DNA(PyCSP和PyHEP17)的混合物免疫接种,以确定这种遗传限制的免疫保护模式是否可被二价DNA疫苗所阻断。结果发现,在B10.BR小鼠中,单价PyCSP或PyHEP17质粒DNA免疫后的保护分别为8%和54%,而两者的混合物同时免疫则可诱导85%的保护率,在BALB/c和A/J两株小鼠中,经二价疫苗免疫后也表现出明显升高的保护率(80%-90%),则另外两株小鼠则未能完全保护,从而导致了疟原虫血症的发生,但其出现时间与对照组相比推迟了4天,与其90%的感染肝细胞被消灭相一致。因此,二价DNA疫苗可保护不同遗传背景和H-2单倍型的小鼠,并在B10.BR小鼠中,这种保护作用呈现叠加效应。这些结果提示,小鼠对核酸疫苗诱发的免疫应答受基因调控,单一效价的疫苗似乎很难对不同遗传背景的个体提供完全的保护作用,而二价的DNA疫苗则可以保护不同遗传背景及H-2单倍型的小鼠,同样也只有二价或多价的核酸疫苗方可保护遗传背景更复杂的人类。同时本试验结果还表明,可用与PyHEP17同源的恶性疟原虫基因构建质粒DNA以进行人体恶性疟原虫的免疫研究。

  1.4 裂殖子表面蛋白DNA疫苗

  约氏疟原虫裂殖子表面蛋白1抗原(PyMSP-1)首先被合成为一种大分子量的前体(190-230kDa,分子量大小与寄生虫种株不同有关),随后被分解成4个片段[10]。大量的证据表明,在鼠类和灵长类疟疾模型中,PyMSP-1也是一种保护性应答(主要为抗体介导的)靶抗原。Kang等[11]将编码PyMSP-1 c端片段(PyC2)与GST融合蛋白(GST-PyC2)的基因构建成一种质粒DNA疫苗(V3),将V3免疫BLAB/c小鼠,可成功地诱导产生抗PyC2抗体。这些抗体可免疫沉淀天然的 pyMSP-1蛋白并可与McAb302(针对PyC2的McAb)竞争结合PyMSP-1的表位,这种竞争作用与GST-PyC2蛋白免疫诱发的抗体相似。但是,与GST-PyC2蛋白免疫产生的抗体相比,这些抗体的滴度及亲和力较低,而抗体的同种型构成和抵抗红内期寄生虫的致死性攻击的保护能力也不相同。与蛋白免疫相比,在DNA免疫过程中,GST或PyC2特异的IgG抗体的亲和力也未见明显的增强。这些结果提示,在本试验系统中,DNA免疫期间可能几乎不存在成熟的特异性抗体亲和力。

  2 伯氏疟原虫的DNA疫苗

  Leitner等[12]用两个表达伯氏疟原虫CSP(PbCSP)水平不同的质粒DNA分别经表皮或肌肉免疫注射BALB/c小鼠,结果表明,延长免疫间隔时间不仅可使抗体的产量增加,而且可增强免疫保护作用。而在经表皮注射的动物中,发现该质粒DNA还可促进CSP特异性IgG同种型IgG1和IgG2a转换,最终两者达到平衡。用基因枪法将高表达质粒经表皮3次免疫动物,每次间隔6周,结果诱导出强烈的体液免疫应答及高水平的保护作用。Gramzinski等[13]用编码用PyCSP的质粒DNA免疫夜猴以进行优化抗体应答方面的研究,结果表明,经皮内途径免疫诱导产生的抗体应答水平与多种抗原肽/佐剂疫苗相似。因此,在夜猴模型中,可应用皮内注射途径进行DNA疫苗的初期研究。同时也表明,该途径适合于诱导针对恶性疟原虫抗原的保护性应答的DNA疫苗研究。

  3 恶性疟原虫的核酸疫苗

  恶性疟原虫子孢子表面蛋白2(PfSSP-2)是一种表达于子孢子及红外期疟原虫膜表面的抗原,也是保护性免疫应答的一种靶抗原。在体内,过继转移PfSSP-2特异的CD8+T细胞可传递对攻击感染的保护作用。用表达PfSSP-2的肥大细胞瘤细胞被动转移也可传递来自CD8+T细胞的保护作用[14]。

  Wang等[15]将分别编码恶性疟原虫PICSP、子孢子表面蛋白-2(PfSSP2)、红外期蛋白(PfEXP2)及肝期蛋白-1(PfLSA1)基因的质粒DNA混合物或编码单一蛋白基因的质粒DNA肌肉注射免疫恒河猴。如果,PfCSP质粒DNA免疫的所有6只猴、PfSSP2质粒DNA免疫的9只猴中的7只、PfEXP2或PfLSA1质粒DNA免疫的6只猴中的5只,它们的外周血单核细胞(PBMC)在体外经抗原刺激均可检测到抗原特异的CTL,且CTL活性受遗传限制,并依赖于CD8+T细胞。本研究首次证明了质粒DNA混合物免疫的灵长类可诱导出针对混合物中所有组分的CD8+T细胞应答,可为人类的多核酸免疫提供基础资料。

  Butler等[16]报道了一项临床试验,用疟原虫CSP基因构建的核酸疫苗与佐剂QS21混合,接种免疫志愿者,结果7名经感染有疟原虫的蚊反复叮咬的志愿者中,有6人获得了保护,证实了核酸疫苗的免疫保护效果。

  Wang等[17]用编码疟原虫抗原蛋白的质粒DNA免疫注射疟原虫未感染的志愿者,结果表明,该疫苗可诱导出抗原特异的、基因限制的CD8+依赖的CTLs,且这种免疫应答受6个HLA1型等位基因的限制。本研究首次证明DNA疫苗可诱导未感染健康人产生CD8+CTLs。同时也证明在同一个体中,CTLs受多个HLA等位基因限制。这些证据将为这种革命性疫苗技术用于人体的进一步研究提供基础资料。

  4 优化疟疾DNA疫苗的策略

  4.1 优化免疫方案

  核酸疫苗在诱导体液应答、CTL应答及保护作用的免疫途径、剂量、次数及其间隔等仍未得到解决,但它们都可能影响核酸疫苗的免疫效果。正如Sedegah等[6]在PyCSP dNA疫苗免疫的试验中,发现抗体的应答水平大约与质粒DNA剂量成正比,而且PyCSP质粒DNA疫苗经2-3次免疫(间隔2-3周)可诱导出对子孢子攻击感染的保护作用,若再进行第四次免疫,结果可引起Th1型免疫应答向Th2型免疫应答转化。除上述影响因素外,研究还发现动物的发育程度也能影响疫苗的效果。Mor等[18]将具有保护作用的质粒DNA[6]用来免疫2-5日龄小鼠,发现它们不仅不能诱导免疫效应,反而诱导了免疫耐受。这种新生期免疫耐受的动物体内经DNA疫苗再次免疫无法诱导出抗体、细胞因子或细胞毒应答。这种耐受特异针对由核酸疫苗编码表达的内源性抗原的免疫原表位,而经外源CSP免疫的小鼠可产生针对不同表位的抗体,而不发生免疫耐受。这些结果表明,与传统的蛋白免疫原相比,DNA疫苗诱发的免疫应答在性质、特异性方面有着明显的差异。

  4.2 改善DNA疫苗的载体

  DNA疫苗研究的最终目的在于利用它来保护人体以抵抗疟原虫感染,因此安全性显得非常重要。为避免外源基因整合进人体细胞染色体中,研究人员在构建载体时将一些病毒DNA序列如SV40的复制起始点剔除掉。同时也可插入一些有利于靶抗原基因表达的序列,如Haddad等[19]构建了可编码疟疾抗原P

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